1、第第 2 课时课时 基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术 学习目标 1.简述基因工程的原理。2.概述基因工程基本操作的几个步骤。 一、基因工程的原理 1.基本原理：让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2.变异类型：基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结 (1)在基因工程中， 不同 DNA 链的断裂和连接产生 DNA 片段的交换和重新组合， 形成了新的 DNA 分子，在这个操作中交换了 DNA 片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的基因重 组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界限，可以定向
2、地改造生物的遗传特性，此操 作均在细胞外进行。 例 1 科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带 DNA 分子。把它注射入组织 中，可以通过细胞的胞吞作用进入细胞内，DNA 被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到 细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA 整合到细胞染色体中的过程属于( ) A.基因突变 B.基因重组 C.基因互换 D.染色体畸变 答案 B 解析 基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体 结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基 因重组。 例 2 下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A.B
3、 淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有 B 淋巴细胞中的抗体基因 B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C.用紫外线照射青霉菌，使其 DNA 发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后将其 DNA 整合到细菌 DNA 上 答案 B 解析 基因工程是在生物体外，通过对 DNA 分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的 基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内，使目的基因在受体细胞内表达，产生出人 类所需要的基因产物，因此，B 项为基因工程。 方法技巧 正确理解基因工程的 5 个方面 操作对象 人们感兴趣的基因(即目的基
4、因) 需要的基本要素 多种工具酶、目的基因、载体、宿主细胞等 常见目的基因 植物的抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、人胰岛素基因和人 干扰素基因等 完成的场所 体外构建重组 DNA 分子，宿主细胞内表达 完成的结果 目的基因稳定和高效地表达，产生人们所需的功能物质 二、基因工程的基本操作步骤 1.获得目的基因的方法 (1)已知序列用化学方法合成；用聚合酶链式反应(PCR)扩增。 (2)未知序列从基因文库中获得。 2.形成重组 DNA 分子 3.将重组 DNA 分子导入受体细胞 (1)常用受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 (2)导入方法举例：用质粒作为载体，宿主细胞应该选择大
5、肠杆菌，用氯化钙处理大肠杆菌， 增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞。 4.筛选含有目的基因的受体细胞 (1)筛选原因：并不是所有的细胞都接纳了重组 DNA 分子。 (2)筛选方法举例：由于质粒上有抗生素如四环素的抗性基因，所以含有这种重组质粒的受体 细胞就能够在有四环素的培养基中生长，而没有接纳重组 DNA 分子的细胞则不能在这种培 养基上生长。经过培养，目的基因能够和质粒一起在宿主细胞内大量扩增。 5.目的基因的表达 (1)目的基因的表达是指目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的功能物质。 (2)常用方法：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原
6、抗体杂交，若有杂交带 出现，表明目的基因已成功表达。 归纳总结 1.获得目的基因的方法 方法 具体操作 从基因文库中 获取目的基因 建立一个包括目的基因在内的基因文库，它包含 DNA 分子的所 有基因，根据有关信息(如基因的功能、表达产物等)来获取目的 基因 PCR 技术扩增目的基因 DNA 受热变性解旋为单链冷却后 DNA 引物与单链相应互补 序列结合在 DNA 聚合酶作用下延伸合成互补链 人工合成 目的基因 逆转录法 目的基因 mRNA 逆转 录酶 单链 DNA 人工 合成 双链DNA 目的基因序列 化学合成法 蛋白质氨基酸序列 推导 mRNA序列 推导 DNA序列 人工合成目的 基因 2
7、.形成重组 DNA 分子的过程 目的基因与载体结合的过程，实质上是不同来源的 DNA 重新组合的过程，是基因工程的核 心。其基本过程如下(以质粒作为载体)： 3.重组 DNA 分子导入不同受体细胞的方法 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法(重组 DNA 分子导入农杆菌， 再让农杆菌感染植物细 胞) 显微注射法(将重组 DNA 分 子提纯，用显微注射仪注射 到受精卵中) 感受态细胞法(Ca2 处 理受体细胞， 使其成为 感受态细胞， 再进行混 合) 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 4.目的基因检测与鉴定的“4 个层面” 例 3 人们试图利用基因工程的方法，用乙种
8、生物生产甲种生物的一种蛋白质。生产流程如 下： 甲生物的蛋白质 mRNA 目的基因 与质粒DNA重组 导入乙细胞 获得甲生物的蛋白质 下列说法正确的是( ) A.过程需要的酶是逆转录酶，原料是 A、U、G、C B.要用限制性核酸内切酶切断质粒 DNA，再用 DNA 连接酶将目的基因与质粒连接在一起 C.如果受体细胞是动物细胞，过程可以用农杆菌转化法 D.参与过程的物质不含有 A、U、G、C 答案 B 解析 过程是逆转录，利用逆转录酶合成 DNA 片段，所以需要的原料是 A、T、G、C，A 错误；过程是目的基因与质粒 DNA 的重组，需要用限制性核酸内切酶切断质粒 DNA，再 用 DNA 连接酶
9、将目的基因与质粒连接在一起，B 正确；如果受体细胞是动物细胞，重组基 因的导入常用显微注射法，农杆菌转化法多用于植物细胞，C 错误；过程是目的基因的表 达，此过程中的 mRNA 和 tRNA 都含有 A、U、G、C，D 错误。 例 4 (2019 嘉兴模拟)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 分子插入到 Ampr或 Tetr中会导致 相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr表示四环素抗性基因)。 有人将此质粒载 体用 BamH酶切后，与用 BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反 应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。
10、被转化 的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组 质粒的大肠杆菌。请回答下列问题： (1)质粒载体作为基因工程的工具， 应具备的基本条件有_(答出 两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅 含环状目的基因的细胞是不能区分的， 其原因是_ _； 并且_和_的细胞也是不能区分的，其原 因是_ _。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使 用含有_的固体培养基。 (3)在实际的基因工程操作时往往用
11、两种限制性核酸内切酶分别切割目的基因的两端以及载 体，回答下列问题： 如果用一种限制性核酸内切酶切割，目的基因两侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互 补的， 因此连接时可能会出现_、 _、 _ 三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。下图为分子间的不同连接产物。 如果用两种不同的限制性核酸内切酶进行切割就可以有效避免_以及 _的连接，提高连接的有效性，克服同种酶切的缺点。 (4)基因工程中， 某些噬菌体经改造后可以作为载体， 其 DNA 复制所需的原料来自_。 答案 (1)能自主复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上 均不生长 含有质粒载体 含有插入
12、了目的基因的重组质粒 二者均含有氨苄青霉素抗性基 因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)载体与载体 目的基因与目的基因 目的基因与 载体 载体与载体 目的基因与目的基因 (4)受体细胞 解析 (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有具有一个至多个限制性核酸内 切酶切割位点、具有标记基因、能够在宿主细胞中复制表达等。(2)在含有氨苄青霉素的培养 基上，只有具有 Ampr的大肠杆菌才能够生长。而 Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环 状目的基因的大肠杆菌细胞中无 Ampr，二者都不能生长；仅含有质粒载体的和含有插入了目 的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有 Ampr，在含有氨苄青霉素
13、的培养基上都能生长。目的基 因的插入破坏了质粒载体的 Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有 四环素的培养基上生长，从而能与仅含有质粒载体的大肠杆菌区分。(4)噬菌体是病毒，无细 胞结构，营寄生生活，无法自主合成 DNA，其所需的原料来自宿主细胞。 易混易错 一个重组 DNA 分子的组成至少应该包括：启动子、终止子、目的基因、标记基 因。原因如下：(1)目的基因是指编码蛋白质的结构基因，若没有启动子，则导入的目的基因 在受体细胞中无法转录。(2)目的基因的表达需要调控序列， 终止子相当于一盏红色信号灯， 使转录到此终止。(3)检测目的基因是否导入受体细胞需要有筛选标记标记
14、基因。 例 5 (2018 丽水高二检测)抗疟药青蒿素挽救了数百万人的生命。中国女科学家屠呦呦由于 在青蒿素研发所做的重大贡献荣获 2015 年诺贝尔生理学奖或医学奖。 青蒿中青蒿素的含量很 低，科研工作者一直致力于提高青蒿素含量的研究。某研究小组给青蒿转入青蒿素合成的关 键基因 fps，通过该基因的过量表达来提高青蒿素的产量，其过程如下图所示(注：农杆菌中 Ti 质粒上只有 TDNA 片段能转移到植物细胞中)。 (1)提取青蒿的总 RNA，在_酶作用下获得青蒿的 DNA 片段。 (2)如果 fps 基因的基因序列已知， 我们可以通过_合成目的基因或者用 PCR 扩增目 的基因；如果 fps
15、基因的基因序列未知，可以从_中获取目的基因。 (3)过程需用同种_酶对含 fps 基因的 DNA 和 Ti 质粒进行酶切。 (4)过程中将青蒿细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让_进入青蒿细胞；除尽 农杆菌后， 还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养， 目的是_ _。 (5)下列有关基因工程的叙述正确的是( ) A.大肠杆菌质粒上具有控制质粒 DNA 转移的基因 B.基因工程的基本原理是让目的基因在宿主细胞中稳定存在和高效复制 C.用氯化钙处理植物细胞，可增加细胞壁的通透性 D.将乙肝抗原导入酵母菌可以获得能生产乙肝疫苗的工程菌 答案 (1)逆转录 (2)化学方法(或人工) 基因文库 (3)限制
16、性核酸内切 (4)TDNA(或目 的基因) 筛选获得 TDNA 片段(目的基因)的植物细胞 (5)A 解析 (1)利用 RNA 获得 DNA， 采用逆转录法， 在逆转录酶的作用下实现。 (2)对于已知序列， 可采用化学方法合成目的基因或用 PCR 扩增目的基因。若 DNA 序列未知，常从基因文库中 获取。(3)过程表示形成重组质粒，采用同种限制性核酸内切酶对含 fps 基因的 DNA 和 Ti 质粒进行酶切。(4)将青蒿细胞与农杆菌混合培养，目的是让 TDNA(目的基因)进入青蒿细 胞，实现目的基因导入受体细胞。将目的基因导入受体细胞后，需将细胞培养在含卡那霉素 的培养基中，原因是质粒上含有卡
17、那霉素的抗性基因，导入重组 DNA 分子的受体细胞可在 培养基上存活，利于筛选获得含 TDNA 片段(目的基因)的植物细胞。(5)大肠杆菌质粒上具 有控制质粒 DNA 转移的基因，A 正确；基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因在宿主 细胞中稳定和高效地表达，B 错误；用氯化钙处理微生物细胞，可增加细胞壁的通透性，C 错误；将乙肝抗原基因导入酵母菌可以获得能生产乙肝疫苗的工程菌，D 错误。 基因工程的基本原理 基因工程的基本操作步骤 获得目的基因 形成重组DNA分子 将重组DNA分子导入受体细胞 筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因的表达 1.判断正误： (1)目的基因的获取一定要用限制性核酸
18、内切酶处理( ) (2)若目的基因的碱基序列未知，可用化学合成法合成目的基因( ) (3)利用 PCR 扩增目的基因时，需要已有的目的基因作为模板( ) (4)构建重组 DNA 时需要用的工具酶有：限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、质粒( ) (5)可用质粒上的标记基因筛选导入重组 DNA 的受体细胞( ) (6)构建重组质粒需要限制性核酸内切酶和 DNA 聚合酶参与( ) (7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因( ) (8)重组 DNA 分子是由目的基因和载体连接在一起构成的( ) (9)将目的基因和质粒连接在一起的重组 DNA 分子导入大肠杆菌中，大肠杆菌一定接纳了重 组
19、DNA 分子( ) (10)每个重组质粒至少含有一个限制性核酸内切酶识别的位点( ) (11)将重组 DNA 分子导入受体细胞中，并筛选出含有重组 DNA 分子的受体细胞，基因工程 就完成了( ) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) 2.(2018 温州瑞安期中)对基因工程操作的叙述，正确的是( ) A.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B.用显微注射法将人生长激素基因直接注入动物的受精卵 C.用氯化钙处理可增加细菌细胞膜的通透性，有利于目的基因的导入 D.利用 DNA 分子杂交技术无法检测目的基因是否表达 答案 D 解析
20、限制性核酸内切酶只能切割特定的脱氧核苷酸序列，而烟草花叶病毒的核酸是由核糖 核苷酸构成的，A 错误；目的基因不能直接导入受体细胞，可用显微注射法将含人生长激素 基因的重组质粒注入动物的受精卵，B 错误；用氯化钙处理可增加细菌细胞壁的通透性，并 使细菌处于感受态，从而有利于目的基因的导入，C 错误；利用 DNA 分子杂交技术只能检 测目的基因是否导入，无法检测目的基因是否表达，D 正确。 3.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因， 该抗性基因的主要作用是( ) A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B.对目的基因是否导入进行检测 C.增加质粒分子的分子量 D.便于与外源基因连接 答
21、案 B 解析 重组 DNA 分子必须具有标记基因，其目的就是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 4.(2019 富阳高二检测)转入人胰岛素原基因(已知序列)的大肠杆菌， 可以合成人胰岛素原， 通 过该项转基因技术可有效地缓解临床上胰岛素不足的难题，从而为糖尿病患者带来福音。在 上述转基因操作过程中，下列说法错误的是( ) A.人胰岛素原基因可用化学方法合成，并用 PCR 技术扩增 B.重组质粒导入受体细胞时通常用氯化钙处理大肠杆菌 C.DNA 连接酶能使不同脱氧核苷酸的碱基与脱氧核糖连接 D.胰岛素原需进一步加工后才可获得具有生物活性的胰岛素 答案 C 解
22、析 人胰岛素原基因的序列是已知的， 故可用化学方法合成， 并用 PCR 技术扩增， A 正确； 由于受体细胞是大肠杆菌，所以在重组质粒导入受体细胞时，要先用氯化钙处理大肠杆菌， 以增加其细胞壁的通透性，B 正确；DNA 连接酶能使脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，C 错误；胰岛素原没有生物活性，需要进一步加工后才能成为有生物活性的胰岛素，D 正确。 5.(2018 浙江 4 月选考，32 节选)回答与基因工程和植物克隆有关的问题： (1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体 pBI121 均用限制性核酸内切酶 EcoR酶切，在切口处形成_。选取含抗虫基因的 DNA 片段与切割后的 pB
23、I121 用 DNA 连接酶连接，在两个片段相邻处形成_，获得重组质粒。 (2)已知用 CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取 CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在 离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成_实验。在离心管中加入液 体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_， 从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。 答案 (1)粘性末端 磷酸二酯键 (2)转化 使 CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 解析 (1)构建重组质粒时限制性核酸内切酶剪切得到的是粘性末端，用 DNA 连接酶连接， 在两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键。 (2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。Ca2 处理方法增加细菌细胞壁的通透性，让其 处于感受态细胞，以利于重组质粒导入。故细胞要正常表达相关基因，应让其恢复为正常状 态。
