1、第 35 讲 基因工程及其安全性1基因工程的诞生() 2.基因工程的原理及技术(含 PCR 技术)( ) 3.基因工程的应用() 4.蛋白质工程( )5实验：DNA 的粗提取与鉴定基因工程的操作工具1基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：无菌。(3)操作水平：DNA 分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体生物体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。2限制性核酸内切酶(简称：限制酶 )(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用：识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部
2、位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)结果：产生黏性末端或平末端。3DNA 连接酶(1)功能：缝合被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。(2)类型常用类型 Ecoli DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶来源 大肠杆菌 T4 噬菌体功能 只“缝合”黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键4.载体(1)常用载体质粒化 学 本 质 ： 双 链 环 状 DNA分 子特 点 能 自 我 复 制有 一 个 至 多 个 限 制 酶 切割 位 点有 特 殊 的 标 记 基 因 )(2)其他载体： 噬菌体衍生物、动植物病毒等。(3)载体的作用：携带外源 D
3、NA 片段进入受体细胞。(选修 3 P6“寻根问底 ”改编)DNA 连接酶和 DNA 聚合酶的作用相同吗？试简要说明。答案：不相同。DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片段，而 DNA 聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。(选修 3 P6“旁栏思考题 ”解答)想一想，具备什么条件才能充当 “分子运输车”？答案：能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等。限制性核酸内切酶 Mun和限制性核酸内切酶 EcoR的识别序列及切割位点分别是C AATTG和G AATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图
4、示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。答案：适合的质粒是。由图可知，质粒上无标记基因，不适合作为载体；质粒和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。考向 1 限制性核酸内切酶、DNA 连接酶等酶的作用1(2019江苏苏锡常镇四市高三调研) 科学家尝试使用 Cre/loxP 位点特异性重组系统，在检测目的基因导入成功后，删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因。其技术过程如下(图中的代表基因前的启动子) ，据图回答下列问题：(1)loxP 是一种只有 34 个碱基对构成的小型 DNA 片段，由两个 13 个碱基对反向重复序列和中间间隔的 8
5、个碱基对序列共同组成，自身不会表达，插入质粒后也不影响原有基因的表达，其碱基序列如下：Cre 酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开 loxP，其功能类似于基因工程中的_酶。(2)将重组质粒导入植物细胞中最常用的方法是_ 。作为标记基因，抗除草剂基因用于检测目的基因是否导入成功的原理是_。(3)经检测成功后，抗除草剂基因已没有用途，继续留在植物体内可能会造成的安全问题是_。经 Cre 酶处理后，质粒中的两个 loxP 序列分别被切开后，可得到如上图右侧的这两个 DNA 分子。由于_的原因，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。(4)loxP 序列是有方向性的。如果经 Cre 酶处理后，发
6、现抗除草剂基因反向连接在质粒一上，则原来质粒一中这两个 loxP 序列的方向是_ 。A两个都是正向 B两个都是反向C一个正向一个反向 D与方向无关解析：(1)根据题意，Cre 酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开 loxP，其功能类似于基因工程中的限制酶。(2)由于抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上，因此作为标记基因，可用于检测目的基因是否成功导入受体细胞。(3)抗除草剂基因留在植物体内可能转移到杂草中造成基因污染。经 Cre 酶处理后，抗除草剂基因前没有了启动子，抗除草剂基因在受体细胞内不再表达。(4)loxP 序列是有方向性的。根据图示 Cre 酶处理后的结果，可知原来质粒一中这两个 l
7、oxP 序列一个正向一个反向，选 C。答案：(1)限制 农杆菌转化法 (2)抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上，可以通过检测抗除草剂基因是否存在，从而判断目的基因是否导入成功 (3)抗除草剂基因可能转移到杂草中 除草剂基因前没有了启动子 (4)C限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst。不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 Pst和 EcoR两种限制酶 (但要确保质粒上也有这两
8、种酶的切割位点，如图乙)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶 Sma会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 考向 2 载体的作用和特点分析2(2019福建龙岩一中实验班月考) 如图所示为 pBR322 质粒，其中 ampr(氨苄青霉素抗性基因) 和 tetr(四环素抗性基因 )为标记基因，ori 为复制原点，其他均为限制酶及其识别位点
9、，并且每种限制酶都只有一个。pBR322 质粒是基因工程较常用的运载体。回答下列相关问题：(1)制备重组质粒，需要限制酶和_酶。如制备重组质粒时，使用 Pvu 切割该质粒，则检测目的基因是否导入受体细胞，需要在培养基中添加_。(2)该质粒中的 BamH识别的核苷酸序列及切割位点为 ，而 Sau3A 识别的核苷酸序列只有 4 个碱基。若 BamH 和 Sau3A 分别切割 DNA 所形成的 DNA 片段能拼接成一条 DNA 链，则 Sau3A 识别的核苷酸序列及切割位点为_。该拼接在一起的 DNA 片段，_(填 “能”“否”或“不一定”) 被 BamH 识别。(3)与图示质粒相比，完整的重组质粒
10、中还应有_ 等三种特殊的 DNA 片段。将重组质粒导入动、植物细胞的方法分别为 _，如受体细胞为大肠杆菌，则该菌经钙离子处理后，将具备_的特性。解析：(1)基因工程所用的工具酶是限制酶和 DNA 连接酶。使用 Pvu 切割 pBR322质粒会破坏 ampr(氨苄青霉素抗性基因 )而 tetr(四环素抗性基因 )不受破坏所以可用含有四环素的培养基来筛选具有目的基因的细胞。(2)综合题目信息，可推知 Sau3A 识别的核苷酸序列及其切割位点为 ，这样Sau3A 和 BamH 切割 DNA 时才能形成相同的黏性末端，进而能拼接成一条 DNA 链。重新拼接点的核苷酸序列不一定是GGATCC，因此不一定
11、能被 BamH 识别，但一定能被 Sau3A 识别。(3)一个完整的重组质粒有标记基因、目的基因、启动子、终止子和复制原点等特殊片段。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，而导入动物细胞的方法有显微注射法。钙离子处理后的大肠杆菌，将处于感受态，该状态的细胞具有将外界 DNA 吸入细胞的特性。答案：(1)DNA 连接 四环素 (2) 不一定(3)启动子、终止子和目的基因 显微注射法，农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法(后者答出一个即可) 将外界 DNA 吸入细胞载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关
12、抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以筛选出转入载体的受体细胞，原理如图所示：基因工程的基本操作1目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。(2)方法从 基 因 文 库 中 获 取人 工合 成 利 用 mRNA反 转 录 合 成通 过 DNA合 成 仪 用 化 学 方 法 人 工 合 成 )利 用 PCR技 术 扩 增 )2基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 ，同时使目的基
13、因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成(3)构建过程3将目的基因导入受体细胞项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 转化法受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞过程将目的基因插入到Ti 质粒的 TDNA 上导入农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA 上表达基因表达载体显微注射受精卵发育新性状个体Ca2 处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA 分子4.目的基因的检测与鉴定如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？(2
14、)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA 上？(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？答案：(1)目的基因是 Bt 毒蛋白基因，载体是 Ti 质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。(2)采用的方法是农杆菌转化法。由于 Ti 质粒上的 TDNA 可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体 DNA 上，而目的基因又插入到了 TDNA 上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体 DNA 上。(3)抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。(2019广东高三模拟)烟草易受烟草花叶病毒 (TMV)感染而大幅度
15、减产。绞股蓝细胞中含有抗 TMV 基因，能抵抗 TMV 感染，研究人员利用转基因技术培育出了抗 TMV 烟草，操作流程如下图所示。请回答下列问题：(1)过程所用 RNA 可以从_中获取。(2)过程可以采用_技术获得大量目的基因，该技术的实质是_。(3)过程最常用的方法是_，该方法中需将目的基因插入受体细胞的_上。(4)过程所用到的培养基除了卡那霉素之外，还需要加入的特殊物质是_。过程还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定，在分子水平上检验获得的烟草能否抗 TMV 的方法是_。解析：(1)根据题图分析可知，表示逆转录过程，其模板 RNA 逆转录形成的 DNA 中含有目的基因(抗 TM
16、V 基因) ，因此该 RNA 可以从绞股蓝细胞的细胞质基质中提取。(2)过程表示获取目的基因的过程，利用 PCR 技术可以大量扩增目的基因，PCR 技术的原理是双链 DNA 的复制。(3)过程表示将目的基因导入受体细胞的过程，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，该方法可将目的基因插入到受体细胞的染色体 DNA 上。(4)过程表示植物组织培养过程，此过程需要在培养基中加入植物激素，如细胞分裂素和生长素；过程表示目的基因的检测与鉴定过程，对于产生的蛋白质可以采用抗原抗体杂交法进行检验。答案：(1)绞股蓝细胞的细胞质基质(2)PCR(或多聚酶链式反应) 双链 DNA 复制(3)农杆菌转化法 染色
17、体 DNA(4)植物激素(或生长素和细胞分裂素) 抗原抗体杂交法基因工程的应用与蛋白质工程1动物基因工程与植物基因工程的应用(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高畜产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。2基因诊断与基因治疗(1)基因诊断：又称为 DNA 诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。(2)基因治疗概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入
18、取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这种淋巴细胞转入患者体内，从而治疗复合型免疫缺陷症。3蛋白质工程(1)概念(2)基本流程写出流程图中字母代表的含义：A转录，B.翻译，C.分子设计 ，D.多肽链，E.预期功能。(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。(4)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。考向 1 基因工程的应用分析1(2019湖南株洲教学质检) 鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员
19、制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：(1)步骤中，利用 PCR 技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_。科研人员还在两种引物的一端分别加上了_和_序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti 质粒内，每种限制酶有_个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列_( 填“相同”或“ 不相同”) 。(2)步骤所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有_，步骤中需先用_处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。(3)步骤中，科研人员提取愈伤组织细胞的 R
20、NA 后，先通过_获得 DNA，再进行 PCR 扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是_。解析：(1)利用 PCR 技术扩增鸡干扰素基因时，引物应可以和鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列进行碱基互补配对，根据鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列可设计引物的碱基序列。据图可知，该转基因过程用 EcoR和 BamH 两种限制酶分别切割目的基因和质粒，以避免质粒或目的基因的自身连接，应在两种引物的一端分别加上 EcoR和BamH 的识别序列 GAATTC 和 GGATCC，以便于后续的剪切和连接。Ti 质粒中每种限制酶有 1 个切割位点，则酶切产物两端黏性末端不同，不会发生自身环化。(2)基因表达
21、载体中除含有启动子、终止子、标记基因和目的基因外，还应含有复制原点，以便在宿主细胞中复制。将基因表达载体导入农杆菌前，可用 Ca2 处理农杆菌，以增大细胞壁通透性，提高转化效率。(3)提取愈伤组织细胞的 RNA 后，可通过逆转录获得 DNA。鸡干扰素基因即便导入了农杆菌，也不一定能导入烟草愈伤组织细胞，导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因不一定能够正常转录，转录出鸡干扰素的 mRNA 若被水解，则不能通过逆转录获得鸡干扰素基因，以上原因均可能导致烟草愈伤组织细胞中不能检测出鸡干扰素基因。答案：(1)鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 1 不相同(2)复制原点 Ca 2(
22、3)逆转录 鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录或鸡干扰素的 mRNA 已经被水解2(2019河南中原名校高三质检) 干旱会影响农作物产量，科学家们对此进行了研究。下图为用基因探针检验某一抗旱植物基因型的原理，相关基因用 R 和 r 表示，回答下列问题：(1)在利用 PCR 技术扩增 R 或 r 基因的过程中，利用_可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。(2)若被检植株发生 A 现象，不发生 B、C 现象。据此推测检测另一抗旱植物时会发生_(填“A”“B” 或“A 或 B”)现象。(3)用从基因文库中获取目的基因的方法获取抗旱基因时需要用到限制酶，限制酶能
23、够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断开。(4)经检测，抗旱基因已经导入到烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的 mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是_。(5)要快速繁殖转基因抗旱烟草植株，目前常用的技术是_ ，该技术的基本过程是：将离体的烟草细胞诱导脱分化形成_，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是：突变体的利用和_。解析：(1)用 PCR 技术扩增 R 或 r 基因时，需要用引物寻找抗旱基因的位置。(2)被检植物发生 A 现象，不发生 B、C 现象，即 r 探针没有形成杂交环
24、，所以被检植物的基因型应为 RR。因此另一抗旱植物的基因型应为 RR 或 Rr，据图分析可发生 A 或 B 现象。(3) 限制酶能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。(4)经检测，抗旱基因已经导入到烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的 mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是基因表达载体上目的基因首端未加入启动子。(5)植物组织培养技术可快速繁殖抗旱烟草植株，该技术包括脱分化和再分化两个基本过程，其中先将离体的烟草细胞诱导脱分化形成愈伤组织，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主
25、要的应用是：突变体的利用和单倍体育种。答案：(1)引物 (2)A 或 B (3)磷酸二酯键 (4)基因表达载体上目的基因首端未加入启动子 (5)植物组织培养技术 愈伤组织 单倍体育种有关基因工程应用的 4 个易错点(1)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。(2)Bt 毒蛋白基因控制合成的 Bt 毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。(3)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。(4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作对象应该是雌性个体，繁殖速度，泌乳量、蛋白含量等都是受体选取时应该考虑的因素。 考向 2 蛋白质工程的概念和过程的辨析
26、3(2018安徽马鞍山二中模拟) 胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，并要经过较长的时间才能进入血液中，而进入血液的胰岛素又容易被分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是_。(2)人工合成的 DNA 与_结合后，被转移到_中才能得到准确表达。(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有_、_和发酵工程。(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？_。解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定
27、需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素，即速效胰岛素的功能。(2)人工合成的目的基因与载体结合后，被导入受体细胞中才能得以表达。(3) 利用蛋白质工程生产自然界中原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，得到目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程将其导入受体细胞获得工程菌，再利用工程菌进行发酵，从而获取大量产品，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中的氨基酸序列，推测出基因中的脱氧核苷酸序
28、列，然后用 DNA 合成仪直接合成出新的基因。答案：(1)蛋白质的预期功能 (2)载体 大肠杆菌等受体细胞 (3)蛋白质工程 基因工程 (4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪来合成出新的胰岛素基因蛋白质工程与基因工程的比较项目 蛋白质工程 基因工程实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果 生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现PCR
29、技术和 DNA 粗提取与鉴定1PCR 技术(1)原理：DNA 双链复制。(2)条件模 板 ： DNA母 链酶 ： Taq DNA聚 合 酶引 物 ： 分 别 与 单 链 相 应 序 列 相 结 合原 料 ： 4种 脱 氧 核 苷 酸 )(3)过程过程 说明 图解变性 当温度上升到 90 以上时，双链 DNA 解聚为单链复性温度下降到 50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合延伸72 左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使 DNA新链由 5端向 3端延伸(4)结果：上述三步反应完成后，一个 DNA 分子就变成了两个 DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以 2n的
30、形式增加。PCR 的反应过程都是在 PCR 扩增仪中完成的。2DNA 的粗提取与鉴定(1)实验原理DNA 与蛋白质在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同项目 溶解规律 2 mol/L NaCl 溶液 0.14 mol/L NaCl 溶液DNA 溶解 析出蛋白质NaCl 溶液物质的量浓度从 2 mol/L 逐渐降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大部分发生盐析沉淀 溶解DNA 不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA 与蛋白质进一步分离。DNA 与二苯胺沸水浴加热，呈蓝色。(2)操作流程材料的选取：选用 DNA 含量相对较高的生物组织破碎细胞(以鸡血为例)：鸡 血
31、细 胞 加 蒸 馏 水 用 玻 璃 棒 搅 拌 用 纱 布 过 滤 收 集 滤 液去除杂质：利用 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，通过控制 NaCl 溶液的浓度去除杂质DNA 的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为 95%的酒精溶液DNA 的鉴定：在溶有 DNA 的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管置于沸水中加热 5 min，溶液变成蓝色下图为“DNA 粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析回答下列问题：(1)操作和都是加入蒸馏水，其目的一样吗？(2)操作中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？(3)操作中的黏稠物是如何获取的？加入
32、 2 mol/L NaCl 的目的是什么？答案：(1)不一样。是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质； 是稀释 NaCl 溶液使其浓度接近 0.14 mol/L，去除溶于低浓度 NaCl 溶液的杂质。(2)中加入酒精的目的是析出 DNA，去除溶于酒精的杂质。这时候搅拌要沿一个方向，轻缓地进行。(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的；加入 2 mol/L NaCl 的目的是使 DNA 再次溶解。考向 1 PCR 技术1PCR 是多聚酶链式反应的缩写，利用 PCR 技术可对目的基因进行扩增。请根据下面 PCR 反应原理示意图回答有关问题：(1)PCR 的原理是_。(2)PCR 技术中 DNA 解链是通过_
33、实现的，DNA 的这种解链现象在一定条件下是_(填“可逆的 ”或“不可逆的”) 。(3)DNA 解链后冷却的目的是_。(4)当温度加热至 7075 时，是_酶把单个脱氧核苷酸通过_键连接到引物上。如此逐渐延伸形成互补链，进而使目的基因加倍。(5)通过重复循环(2) 、(3) 、(4)过程，使目的基因以_形式扩增。解析：(1)PCR 的原理是 DNA 双链复制。(2)PCR 技术通过高温加热使 DNA 解链，DNA 的这种解链现象在一定的条件下是可逆的，即降低温度后能复性。(3)DNA 解链后冷却的目的是让引物与互补 DNA 链相结合，形成局部双链。 (4)当温度加热至 7075 时，是热稳定
34、DNA 聚合酶把单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物上。(5)PCR 技术中，目的基因以指数形式扩增。答案：(1)DNA 双链复制 (2)高温加热 可逆的(3)让引物与互补 DNA 链相结合 (4)热稳定 DNA 聚合 磷酸二酯 (5)指数生物体内 DNA 复制与 PCR 反应的区别项目 体内 DNA 复制 PCR 反应解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分双链解开 加热至 90 ，双链全部解开，不需要解旋酶引物 一小段 RNA 可以是 RNA 或单链 DNA 分子片段合成子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度 72 特点
35、边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增Taq DNA聚合酶 不需要 需要循环次数 受生物体自身控制 30 多次相同点 生物体内的 DNA 复制和 PCR 反应体外 DNA 扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行考向 2 DNA 的粗提取与鉴定2实验中对 DNA 进行鉴定时，有如下操作：试管序号 A B1 加 2 mol/L 的 NaCl 溶液 5 mL 加 2 mol/L 的 NaCl 溶液 5 mL2 不加 加入提取的 DNA 丝状物并搅拌3 加 4 mL 二苯胺，混匀 加 4 mL 二苯胺，混匀4 沸水浴 5 分钟 沸水浴 5 分钟实验现象实验结论(1)根据上图，完
36、成表格空白处的实验内容。(2)对于 B 试管，完成 1、2、3 的操作后溶液颜色如何变化？_。(3)在沸水浴中加热的目的是_，同时说明 DNA 对高温有较强的_。(4)A 试管在实验中的作用是 _。(5)B 试管中溶液颜色的变化程度主要与_有关。解析：A、B 两试管形成对照，B 试管中含 DNA 丝状物，A 试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热 5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。答案：(1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA 在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色(2)溶液颜色基本不变(3)加快颜色反应速度 耐受性
37、(4)对照(5)加入试管中的 DNA(丝状物)的多少DNA 的粗提取与鉴定中的“2、3、4”加蒸馏水 2 次加到鸡血细胞中，使血细胞吸收水破裂；加到含 DNA 的 2 mol/L 的 NaCl 溶液中，使 NaCl 溶液的物质的量浓度下降到 0.14 mol/L，使 DNA 析出用纱布过滤3 次过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；滤取 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中析出的 DNA(黏稠物) ；过滤溶有 DNA 的 2 mol/L 的 NaCl 溶液用 NaCl 加 2 mol/L 的 NaCl 溶液，溶解提取的细胞核物质；溶液4 次用 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液
38、使 DNA 析出；用 2 mol/L 的 NaCl 溶液，溶解滤取的 DNA 黏稠物；用 2 mol/L 的 NaCl 溶液，溶解丝状物用于鉴定 DNA清一清易错点 1 误认为目的基因的插入位点是“随机”的点拨 目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去原功能。易错点 2 误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”点拨 (1)在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在 DNA 连接酶的作用下目的基因与
39、载体也可以连接起来。(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“ 环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。易错点 3 混淆启动子与起始密码子，终止子与终止密码子，不明确标记基因的作用点拨 启动子起始密码子，终止子终止密码子。(1)启动子：一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端。它是 RNA 聚合酶识别、结合的部位。(2)终止子：一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。(3)起始密码子和终止密码子位于 mRNA 上，分别控制翻译过程的启动和终止。(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其
40、作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功 )，从而将含目的基因的细胞筛选出来。易错点 4 误认为基因工程可导致受体细胞或生物产生“新基因”或“新蛋白质”点拨 基因工程的实质是“基因重组”，它是将外源基因导入受体细胞，使该基因在受体细胞中表达由于“外源基因”是自然界已存在的“现成”基因，故基因工程并未产生新基因，因此目的基因表达时也未产生新蛋白质，基因工程只不过是让受体细胞(或生物) “实现了外源基因的表达 ”。判一判(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别 6 个核苷酸序列 ( )(2)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( )(3)DNA 连接
41、酶能将两碱基间通过氢键连接起来( )(4)限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( )(5)Ecoli DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( )(6)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达( )(7)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( )(8)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( )(9)应用 DNA 探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达( )(10)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操
42、作，定向改变分子的结构( )(11)进行 DNA 粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨( )(12)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度( )(13)将制备的含有 DNA 的滤液加入 6075 的恒温水浴箱中保温 1015 min，可以将 DNA 析出( )答案：(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13)(2018高考全国卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer) 和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作
43、为载体外，还证明了_(答出两点即可 )。(2)体外重组的质粒可通过 Ca2 参与的_方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体 DNA 通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体 DNA 导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。解析：(1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞
44、的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是：首先用 Ca2 处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态细胞。噬菌体 DNA 没有侵染能力，体外重组的噬菌体 DNA 通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑
45、制剂。答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白 ) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶(2018高考全国卷 )某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP 基因的 5末端。获得了 L1GFP 融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒 P0，构建了真核表达载体 P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中 E1E4 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒 P0 时，使用了两种限制酶，这两种酶是_，使用这两种酶进行酶切是为了保证_，也是为了保证_。(2)将 P1 转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1基因在牛的皮肤细胞中完成了_和_过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_移入牛的_
