1、模块六 专题十六1(2018深圳调研)叶绿体转基因技术是将外源基因整合到叶绿体基因组中，该技术能有效改良植物的品质。请回答：(1)转基因技术的核心步骤是_基因表达载体的构建_，完成该步骤所需要的酶有 _限制酶和 DNA 连接酶_。(2)将植物体细胞处理得到原生质体，再通过_农杆菌转化法 _或_基因枪_法，将目的基因导入原生质体，使原生质体再生出细胞壁之后，通过_植物组织培养_技术培养可得到相应的转基因幼苗。(3)来自原核生物中有重要价值的外源基因，无需改造和修饰就可在叶绿体中高效表达，就此分析，原因是_叶绿体 DNA 与原核生物 DNA 结构类似( 由于叶绿体大多数基因的结构、转录与翻译系统均
2、与原核生物类似) _。(4)对大多数高等植物而言，与传统的细胞核转基因相比，叶绿体转基因更稳定，其遗传方式_不遵循_(答“遵循”或 “不遵循”) 分离定律，不会随 _花粉_(“花粉”或“卵细胞”)传给后代，从而保持了_母本_( “父本”或“母本”) 的遗传特性。解析 (1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，所需要的酶有限制酶和 DNA 连接酶；(2)植物细胞导入受体细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。原生质体再生细胞壁之后，通过植物组织培养获取幼苗；(3)叶绿体 DNA 与原核生物 DNA 结构类似。(4) 分离定律适用于有性生殖过程中细胞核遗传，故叶绿体转基因不遵循分离定
3、律，为母系遗传。2(2018天津市和平区生物一模) 已知某传染性疾病的病原体为 RNA 病毒，该病毒表面的A 蛋白为主要抗原。疫苗的生产和抗体的制备流程如图 1 所示。请回答下列问题：(1)过程代表的是_逆转录_，过程构建 A 基因重组载体时，启动子和终止子是重新构建的，它们应该能被受体细胞的_RNA 聚合酶_所识别，以便于其催化转录过程。(2)如图 2 为 A 基因的结构示意图，已知 区的碱基数是 2000 个，其中阴影区域碱基数是800 个，空白区域中 G 和 C 的总数共有 400 个，则由该区域能指导蛋白质合成的片段转录产生的 mRNA 中 A 和 U 总数是_400_个。(3)在给小
4、鼠皮下注射 A 蛋白时，要重复注射几次的目的是通过二次免疫，增加小鼠体内的_浆细胞_数目。(4)在将 X 进行扩大培养前，至少需要经过 2 次筛选，第一次是将_杂交瘤细胞_筛选出来，第二次是将_能分泌所需抗体的杂交瘤细胞_筛选出来。(5)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的_A 蛋白_来制备疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以从疑似患者体内分离出病毒与已知病毒进行核酸序列比较，或用图中的_抗 A 蛋白的单克隆抗体 _与分离出的病毒进行特异性检测。解析 (1)由以上分析可知是逆转录。启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的位点，能启动转录过程。(2) 已知图中区的碱基数是 200
5、0 个，其中阴影区域碱基数是 800 个，则空白区域中碱基总数为 1200 个，又已知空白区域中 G 和 C 的总数为 400 个，则 AT 总数为 800 个，每条链中 AT 总数为 400 个，根据碱基互补配对原则，由该区转录形成的成熟 mRNA 中 A 和 U 总数也是 400 个。(3)在给小鼠皮下注射 A 蛋白时，要重复注射几次的目的是通过二次免疫，增加小鼠体内的浆细胞数目。(4)在将 X 进行扩大培养前，至少需要经过 2 次筛选，第一次是用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次是采用抗体阳性检测法筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。(5)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因
6、工程生产的 A 蛋白所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以从疑似患者体内分离出病毒，与已知病毒进行核酸序列比较；或采用抗原抗体杂交法，即用图中的抗 A 蛋白的单克隆抗体进行特异性结合检测。3如图为三种质粒和一个含目的基因的 DNA 片段，其中 ApR 为氨苄青霉素抗性基因，Tc R为四环素抗性基因，lacZ 为蓝色显色基因，Eco R (0.7 kb)、Pvu (0.8 kb)等为限制酶和其切割位点及其与复制原点之间的距离。已知 1 kb1 000 个碱基对，请回答下列问题：(1)片段 D 为目的基因中的某一片段，则 DNA 聚合酶和 DNA 连接酶的作用形成的键依次是_( 填图中数字)
7、。(2)图中作为目的基因运载体最理想的质粒是_B_(填“A”“B”或“C”)，请据图分析，其他两种质粒一般不能作为运载体的理由分别是_质粒 A 不含有标记基因；质粒 C 在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被破坏，使该质粒无法进行复制_。(3)用 EcoR 全酶切目的基因和质粒 B 形成的重组质粒，并进行电泳观察，可出现长度分别为 11 kb 和 _5.6_kb 的两个片段，或者长度分别为_3.6_kb 和 3.1_kb_的两个片段(重组质粒上目的基因的插入位点与 EcoR的识别位点之间的碱基对忽略不计)。(4)将分别用限制酶 Pvu切开的质粒 B 溶液与目的基因溶液混合，加入 DNA
8、 连接酶后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作，则受体细胞的类型包含_ABD_( 多选)。AAp R 蓝色 BAp R 白色CAp S、蓝色 DAp S 白色(5)动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是_B_。A受精卵能使目的基因高效表达B受精卵可发育成动物个体C受精卵更易接受 DNA 的插入D受精卵体积较大，便于 DNA 导入操作解析 (1)DNA 聚合酶和 DNA 连接酶的作用形成的键均为磷酸二酯键，因此都应为。(2)由题图可知，切割目的基因应用 Pvu，但该限制酶会将 c 质粒的复制原点破坏，使该质粒无法进行复制，而质粒 A 不含有标记基因，因此两者都不能作为运载体。(3) 根据题意
9、，质粒 B 长度为2.7 kb，目的基因长度为 4.0 kb，所以重组质粒长度为 6.7 kb，如果出现长度为 11 kb 的一个片段，则另外一个片段的长度为 5.6 kb。若目的基因与运载体反向连接，可形成长度分别为 3.1 kb和 3.6 kb 的两个片段。(4) 将分别用限制酶 Pvu切开的质粒 B 溶液与目的基因溶液混合，加入DNA 连接酶后，可得到质粒自身环化形成的普通质粒、重组质粒和目的基因自身连接的 DNA环三种类型。如果导入的是普通质粒，受体细胞的类型为 A(ApR、蓝色)，如果导入的是重组质粒，受体细胞的类型为 B(ApR、白色) ，如果导入的是 DNA 环，受体细胞的类型为
10、 D(ApS、白色)。(5)动物基因工程通常选用受精卵作为受体细胞的根本原因是受精卵可发育成动物个体。4人乳头状瘤病毒(HPV)与宫颈癌的发生密切相关，抗 HPV 的单克隆抗体可以准确检测出HPV，从而及时监控宫颈癌的发生，以下是以 HPV 衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程，请据图回答下列问题：(1)单克隆抗体制备过程中涉及的细胞工程技术有_动物细胞培养、动物细胞融合 _。(2)若要分析杂交瘤细胞中染色体，可通过_解离、漂洗、染色和制片 _等过程制成装片，然后在显微镜下观察。杂交瘤细胞中染色体数目与普通淋巴细胞相比具有的特点是_染色体数目加倍_，在 HAT 培养基上存活的细胞可能包括 _
11、_(填下列序号)。无抗体分泌的细胞抗 HPV 抗体的分泌细胞其他无关抗体的分泌细胞(3)对于抗体检测呈_阳_性的杂交瘤细胞应尽早进行克隆化，克隆化的方法最常用的是有限稀释法，即稀释细胞到 310 个/ mL，每孔加入细胞稀释液 _0.1_mL，使每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的。(4)由上述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体，理由是_小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，存在着排异反应_。(5)科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出了无限增殖调控基因(prG)，该基因能激发动物细胞分裂，这为单克隆抗体的制备提供了更多的思路。除本题描述的制备单克隆抗体技术外，请再简要写出一种制备单克
12、隆抗体的思路。_通过基因工程向浆细胞中导入 prG；利用核移植技术将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中(答对其一即可)_。解析 (2)利用显微镜观察有丝分裂过程中的染色体，需先制作临时装片；杂交瘤细胞中含有浆细胞和骨髓瘤细胞的染色体，所以比普通淋巴细胞的染色体数目多一倍；在 HAT 培养基上生存的细胞均为杂交细胞，这些杂交细胞中有分泌 HPV 抗体的细胞，有分泌其他抗体的细胞，也有不能分泌抗体的细胞。(3)抗体检验呈阳性，说明该杂交瘤细胞可产生所需抗体；为保证每个小孔不多于一个细胞，根据浓度可推断加入细胞稀释液的量：设加入细胞稀释液的最大量是X，则 10 个/ mLX1 个，X 0.1
13、mL。(4) 小鼠形成的抗体与人体抗体不同，故在人体内可引起免疫反应，所以上述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体。(5)根据所给信息可知，还可通过转基因技术或核移植技术获得既能大量增殖，又能产生特定抗体的杂交细胞。5(2017陕西西安长安一中第一次检测) 下图是植物体细胞杂交过程示意图，请据图回答：(1)植物体细胞杂交的第步是去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体。目前此步骤最常用的方法是酶解法，也就是在温和的条件下用_纤维素酶、果胶酶_等分解植物的细胞壁。(2)过程的发生，必须进行人工诱导。人工诱导原生质体融合常用的化学方法是用_聚乙二醇_试剂作为诱导剂诱导融合。动物细胞融合还常用到_灭活的
14、病毒_作为诱导剂。(3)与过程密切相关的具有单层膜结构的细胞器为_高尔基体 _。(4)过程称为_脱分化_，过程称为_再分化_。若利用此技术生产治疗癌症的药物 紫杉醇，培养将进行到_e_( 填字母编号) 即可。(5)植物体细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的优点是可以_克服远缘杂交不亲和的障碍_。解析 (1)植物体细胞杂交的第步是用纤维素酶和果胶酶去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体。(2)人工诱导原生质体融合常用的化学方法是用聚乙二醇试剂作为诱导剂诱导融合。动物细胞融合还常用到灭活的病毒作为诱导剂。(3)过程是杂种细胞生出细胞壁，高尔基体与植物细胞壁形成有关。(4)过程分别为脱分化和
15、再分化，治疗癌症的药物 紫杉醇是从紫杉细胞中提取的，只需将植物组织培养进行到愈伤组织阶段即可。(5)植物体细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的优点是可以克服远缘杂交不亲和障碍，大大扩展可用于杂交的亲本组合范围。6(2018全国卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP 基因的 5末端，获得了 L1GFP 融合基因( 简称为甲)，并将其插入质粒 P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中 E1E4 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题
16、：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒 P0 时，使用了两种限制酶，这两种酶是_E1 和E4_。使用这两种酶进行酶切是为了保证_甲的完整_，也是为了保证_甲与载体正确连接_。(2)将 P1 转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1 基因在牛的皮肤细胞中完成了_转录_和_翻译_过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_细胞核_移入牛的_去核卵母细胞_中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用 PCR 方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_核 DNA_(填“mRNA” “总
17、 RNA”或“核 DNA”)作为 PCR模板。解析 (1)由题意可知，L1 基因和 GFP 基因合成了 L1GFP 融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将 L1GFP 融合基因插入质粒 P0 时，可用 E1 和 E4 限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1GFP 融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用 PCR 技术扩增目的基因
18、，可以检测目的基因是否存在。PCR 扩增的模板是 DNA。7(2018天津卷)甲型流感病毒为 RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在 2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒 RNA 为模板，逆转录成对应 DNA 后，利用_PCR_技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的_多肽( 或蛋白质) _，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建
19、适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊 tRNA 的基因，其产物的反密码子能与(1) 中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸 (Uaa)。将该基因与_载体_连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的_总 RNA_进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加_非天然氨基酸(Uaa)_的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊 tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊 tRNA 基因转录时，识别其启动子的酶是_D_(单选 )。A病
20、毒的 DNA 聚合酶 B宿主的 DNA 聚合酶C病毒的 RNA 聚合酶 D宿主的 RNA 聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起_细胞_免疫，增强免疫保护效果。解析 (1)体外进行 DNA 扩增采用的技术手段是聚合酶链式反应(PCR 技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质 )。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体( 运载体)连接后导入受体细胞。利用
21、分子杂交技术鉴定，筛选获得成功表达目的 RNA 的细胞时，需提取宿主细胞的总 RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有 Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入 Uaa。转录时，识别启动子的酶为 RNA 聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的 RNA 聚合酶。(4)不具有感染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。8(2018江苏卷)为生产具有
22、特定性能的 淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了淀粉酶基因(1 656 个碱基对 )，利用基因工程大量制备 淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：(1)利用 PCR 技术扩增 淀粉酶基因前，需先获得细菌的_基因组 DNA_。(2)为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的_5_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_使 DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连_。(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。(填序号 )变性温度 退火温度 延伸温度 变性时间 退火时间
23、 延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码 淀粉酶的 mRNA 的部分碱基序列：图中虚线框内 mRNA 片段包含_8_个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_13_种。(5)获得工程菌表达的 淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为 1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：缓冲液50 mmol/LNa2HPO4KH 2PO450 mmol/LTris HCl50 mmol/LGlyNaOHpH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5酶相对活性%25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.
24、5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8根据上述实验结果，初步判断该 淀粉酶活性最高的条件为_pH 为 8.5，缓冲液为50_mmol/L TrisHCl_。解析 (1)利用 PCR 技术扩增 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组 DNA 作为模板，并依据 淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用 PCR 技术扩增 DNA 时，只能从 3端延伸 DNA 子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的 5端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连
25、接。(3)PCR 技术包括变性、退火( 复性)和延伸三步，变性温度决定 PCR 反应中双链 DNA 的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的 DNA 单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及其浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在 1 kb 以内的延伸时间为 1 min 左右，34 kb 的延伸时间为 34 min 。(4)图中虚线框内共含有 24 个碱基，mRNA 上 3 个相邻的碱基编码 1 个氨基酸，故共包含 8个密码子。虚线框后的第 1 个密码子的第 1 个碱基是 U，第 2 和第 3 个碱基各有 4 种可能性，因此共 16 种可能性。题干表明控制 淀粉酶的基因有 1 656 个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3 种终止密码子为 UAA、UAG 、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有 16313 种可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为 99.5%，对应的条件是 pH 为 8.5，缓冲液为 50 mmol/L TrisHCl。
