1、 第第 1 课时课时 微生物的分离和培养微生物的分离和培养 学习导航学习导航 1.简述高压蒸汽灭菌锅的使用方法及注意事项。2.掌握制备细菌培养基的方法。 3.学会利用无菌操作技术接种与培养大肠杆菌。 重难点击重难点击 1.培养基的配制方法及常见种类。2.大肠杆菌的接种与分离培养。 一、微生物分离和培养的基本理论一、微生物分离和培养的基本理论 1无菌操作技术 实验室常利用高温处理达到灭菌效果，包括采用干热灭菌或湿热灭菌等方法。 (1)干热灭菌方法是将拟灭菌的物品放在干热灭菌箱内，在 160170 温度下加热 12 h 以 达到灭菌的目的。 (2)湿热灭菌方法常采用高压蒸汽灭菌锅进行，如手提式高压
2、蒸汽灭菌锅就是实验室常用的灭 菌仪器之一。高压蒸汽灭菌锅的使用包括加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等步骤。 2配制培养基 (1)培养基概念：为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基 质。 (2)培养基类型 天然培养基：采用动植物组织或微生物细胞以及它们的提取物或粗消化物配制而成，如牛 肉膏蛋白胨培养基。 优点：取材便利、营养丰富、配制简便； 缺点：营养成分难以控制、实验结果的重复性较差。 合成培养基：由准确称量的分析纯等级别的高纯度化学试剂加蒸馏水配制而成，如葡萄糖 铵盐培养基。 优点：化学成分及其含量明确、实验的可重复性好； 缺点：配制繁琐、成本较高。 (3)培
3、养基成分：一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐 等最基本的物质。 (4)培养基的配制原则：在配制培养基时，根据拟培养的微生物的不同需要，有时还要加入维 生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的 pH 使之满足微生物生长的需要。 3接种微生物 (1)接种的概念：在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。 (2)常用的接种工具：玻璃涂布器、接种针、接种环等。 (3)接种方法 用接种针进行穿刺接种。 用接种环进行斜面接种或在固体培养基平板上进行划线接种。 用玻璃涂布器进行涂布平板接种等。 1“无菌操作”与人们的生活休戚相关，无时无处不在。在日常生活、生产实践、自身健
4、康 防护中，有哪些“无菌操作”的例子？ 答案 日常生活、生产实践、自身健康防护中“无菌操作”的例子分别有：(1)被褥、鞋袜要 常晒；肉制品储存时用盐腌等。(2)家畜阉割后，要在其伤口处涂抹一些酒精或白酒；初冬杨 树树干涂刷生石灰水等。(3)打针时，注射部位要用酒精棉球擦洗，一般要在其伤口处涂抹一 些碘酒。 2实验室常利用高温处理达到灭菌效果，包括采用干热灭菌或湿热灭菌等方法。以下图高压 蒸汽灭菌锅的使用为例，探究无菌技术的方法。 (1)高压蒸汽灭菌的使用原理是什么？ 答案 使用原理： 将待灭菌物品放在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内； 把锅内的水加热煮沸， 并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭；
5、再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从 而温度也随之上升到 100 以上。 (2)简述手提式高压蒸汽灭菌锅的使用步骤。 答案 加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等。 (3)消毒和灭菌的原理是什么？消毒和灭菌都能杀死所有的微生物吗？是否适用于所 有的生物和物品？ 答案 都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。 灭菌可杀死处理材料中的全部微生物(包括芽孢和孢子)，而消毒仅能杀死物体表面或内部 的部分微生物(一般不包括芽孢和孢子)。不是，无菌技术既要考虑效果，又要考虑操作对 象的承受能力。例如，活体生物材料、操作者的双手等只能消毒，而不能灭菌。 (4)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外
6、来微生物污染外，还有什么目的？ 答案 还能有效避免污染环境以及操作者自身被微生物感染。 3微生物的培养离不开培养基，根据下面某微生物培养基的配方回答下列问题： 成分 含量 NaNO3 3 g K2HPO4 1 g KCl 0.5 g MgSO4 7H2O 0.5 g FeSO4 0.01 g C6H12O6 30 g H2O 1 000 mL 青霉素 0.1 万单位 (1)该培养基的碳源、氮源分别是什么？ 答案 碳源：C6H12O6；氮源：NaNO3。 (2)依据物理性质、用途划分，该培养基分别属于什么培养基？ 答案 依据物理性质划分，该培养基属于液体培养基；依据用途划分，则属于选择培养基。
7、(3)用该培养基培养的微生物可能是什么？ 答案 根据培养基的原料，所培养微生物的同化作用的类型是异养型，培养的微生物可能是 酵母菌或霉菌。 (4)在固体培养基中加入的琼脂能为微生物提供营养吗？为什么？ 答案 不能，微生物不能分解琼脂。 (5)普通培养基能培养病毒吗？为什么？ 答案 不能，因为病毒只能在活细胞中营寄生生活。 整合提升 (1)消毒与灭菌的区别 项目 条件 结果 常用的方法 消毒 较为温和的物 理学方法或化 学方法 仅杀死物体上绝大多数微 生物(包括病原微生物和 有害微生物的营养细胞) 煮沸消毒法(在 100 下 56 min 可以杀死微生物的营养细胞和一 部分芽孢)、巴氏消毒法、化
8、学药 剂消毒法 灭菌 强烈的物理学 或化学方法 杀死物体内外所有的微生 物，包括芽孢和孢子 干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌 (2)培养基的成分及功能 营养要素 含义 作用 主要来源 碳源 凡能提供所需碳 元素的物质 构成生物体细胞的物质 和一些代谢产物，有些 是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3 等；有机碳源：糖类、脂肪 酸、花生饼粉、石油等 氮源 凡能提供所需氮 元素的物质 合成蛋白质、核酸以及 含氮的代谢产物 无机氮源：NH3、铵盐、硝 酸盐等；有机氮源：尿素、 牛肉膏、蛋白胨等 生长因子(特 殊营养物质) 生长必不可少的 微量有机物 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、
9、碱基等 水 在生物体内含量 很高，在低等生 物体内含量更高 不仅是优良的溶剂，而 且可维持生物大分子结 构的稳定 培养基、 大气、 代谢产物等 无机盐 为微生物提供除 碳、氮元素以外 的各种重要元 素，包括某些大 量元素 细胞内的组成成分；生 理调节物质；某些化能 自养菌的能源；酶的激 活剂 培养基、大气等环境 1下列常用的无菌操作中，错误的是( ) A无菌操作不要求杀死培养基中的一切细菌 B用酒精擦拭双手的方法是对操作者进行消毒 C实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行 D玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭 答案 D 解析 无菌技术是用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，而不是杀死培养基
10、中的 一切细菌；对操作者应用较温和的方法进行消毒，如酒精擦拭；实验操作过程应在酒精灯火 焰附近进行，防止杂菌污染；对无菌操作用到的玻璃器皿要用干热灭菌的方法彻底消灭其中 的微生物，用酒精擦拭不能达到目的。 2下列关于培养基的说法正确的是( ) A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基 C除水以外的无机物只能提供无机盐 D无机氮源不可能提供能量 答案 A 解析 根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培 养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如 NH4HCO3， 既可以是碳源， 也可以是
11、氮源， 不仅仅提供无机盐； 无机氮源有时也能提供能量， 如 NH3可以为硝化细菌提供能量。 方法链接 培养基的种类 分类标准 培养基种类 培养基特点 作用 物理性质 固体培养基 外观呈固态 微生物的分离、计 数等 半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈振动则 破散 观察微生物的运 动、鉴定菌种等 液体培养基 呈液态 常用于工业生产 功能 选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同 时抑制或阻止其他微生物生长 选择、分离 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养 基中加入某种指示剂或化学药品 鉴定 成分来源 天然培养基 化学成分还不清楚 工业上大规模的微 生物发酵生产 合成培养基 化学成分完全了解
12、在实验室用来对微 生物分析 二、大肠杆菌的接种与分离培养二、大肠杆菌的接种与分离培养 1配制牛肉膏蛋白胨培养基 配制培养基 调节pH 分装 包扎 灭菌 搁置斜面 2斜面接种和培养大肠杆菌 斜面接种大肠杆菌的主要目的有菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。具体操作步骤： 准备接种 接种环灭菌 试管口灭菌 挑取少许菌种 划线接种 培养大肠杆菌 保存菌种 3平板划线分离和培养大肠杆菌 在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。 (1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作 配制好的培养基装瓶 加棉塞 灭菌倒平板(A.打开瓶塞B.灼烧瓶口灭菌C.倒培养基D.倒 置平板)。 (2)平板划线分离与培养大肠
13、杆菌 平板划线法的含义：用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微 生物的一种方法。 注意事项：接种和划线操作时需要在酒精灯火焰附近进行。 1利用培养基培养微生物时，首先要把微生物接种到培养基上。以牛肉膏蛋白胨培养基的配 制为例，完成下列有关问题： (1)以下为细菌培养基的配制的流程，若将分装步骤与调节 pH 步骤颠倒过来是否可行？ 配制培养基 调节pH，数值为7.2 分装 包扎 灭菌，常用方法为高压蒸汽灭菌 搁置斜面，需冷却至50 左右 答案 不行。若分装后再调节 pH，会使培养基的 pH 调节不均匀；还可能将培养基弄到试管 口，易被污染。 (2)从防止杂菌污染的角度思考，
14、平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？ 答案 平板冷凝后， 皿盖上会凝结水珠， 凝固后的培养基表面的湿度也比较高， 将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。 2斜面接种和培养大肠杆菌 (1)下图接种方法分别是什么？ 答案 图 1 是穿刺接种、图 2 是斜面接种、图 3 是平板划线接种。 (2)下表是关于接种操作步骤及其目的或分析说明，请完善下表。 顺序 接种操作步骤 分析说明或目的 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环 烧红 将接种环灭菌，避免污染菌种 在火焰旁冷却接种环，拔去试管棉塞 避免杂菌污染菌种 将试管口通过火焰 灼烧灭菌， 防止试管口菌体
15、污染培养基 将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环 部接触斜面顶端 使接种环冷却，避免杀死菌种 抽出接种环时，带菌部分不要触及管壁 或通过火焰 防止菌种沾于管壁， 防止菌种被杀死 在培养基斜面上由底部向上轻轻划 “S”型曲线，但不要将培养基表面划破 初步接种。 划破培养基不利于后续的 继续划线，长出的菌落不标准 将试管口与试管塞通过火焰 23 次，迅 速塞紧试管 防止杂菌污染 将接过种的试管， 放在恒温箱(37 )中培 养 24 h 培养细菌，观察接种和培养的结果 3.平板划线分离和培养大肠杆菌 在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。思考回答下列相关问题： (1)平板划线法接种菌种时，
16、哪些操作可防止杂菌污染？ 答案 接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却 后再划下一区域。接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。划线时将培养皿 打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。 (2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。 (3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ 答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划 线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种 环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次
17、数的增加，使每次划线时菌种的数 目逐渐减少，是为了保证菌落是由单一的细菌繁殖而成。 (4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答案 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境 和感染操作者。 (5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答案 划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随 划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。 (6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？ 答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的 数目，达不到纯化的效果。
18、 3关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中，不正确的是( ) A配制固体培养基时一般要加适量的琼脂 B分装到试管中的液体培养基的高度约为试管高度的 1/2 C待培养基冷却至 50 左右时进行搁置斜面 D搁置斜面时，斜面长度不超过试管总长的 1/2 答案 B 解析 在配制固体培养基时，琼脂是最常用的凝固剂，A 项正确；分装到试管中的液体培养 基的高度约为试管长度的 1/5，B 项错误；待培养基冷却至 50 左右时进行搁置斜面，以防 培养基因温度过高而烫手，也要防止培养基因温度过低而凝固不能形成平板，C 项正确；搁 置斜面时，将试管口部枕在高约 1 cm 的木条或其他合适高度的物体上，使其自然倾斜
19、，斜 面长度不超过试管总长的 1/2，D 项正确。 4在接种操作的过程中，不正确的是( ) A要将接种环灼烧灭菌 B取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌 C将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位 D接种后还要将管口灭菌加塞 答案 C 解析 接种环伸入试管内，先接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位，待接种环冷 却后再接触长菌部位。 5 下图是微生物平板划线示意图， 划线的顺序为 1、 2、 3、 4、 5。 下列操作方法正确的是( ) A操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌 B划线操作须在火焰上进行 C在 5 区域中才可以得到所需菌落 D在 1、2、3、4、5 区域中划线前后都要对接种环灭菌 答案
20、D 解析 在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种 时划线操作在火焰边进行； 在 5 个区域中， 只要有单个活细菌， 通过培养即可获得所需菌落。 一题多变 (1)平板划线法所用培养基属于什么培养基？ 答案 琼脂固体培养基。 (2)如何确认制备的培养基是否合格？ 答案 将一个未接种的培养基同接种培养基一起培养，若未接种的培养基无菌落生长，说明 制备的培养基合格，否则需要重新制备。 (3)如果培养基上长出的菌落相互重叠，则说明存在什么问题？ 答案 说明划线不充分，应该重新操作。 (4)在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于哪里？ 答案 接种环上的菌种直接来源
21、于上次(第一区中)划线的末端。 1下图是灭菌锅及其局部剖面示意图，其中甲、乙、丙依次指( ) A安全阀、排气阀、压力表 B排气阀、安全阀、压力表 C安全阀、排气阀、温度表 D排气阀、安全阀、温度表 答案 A 解析 根据教材 P8图高压蒸汽灭菌锅结构示意图，可判断甲、乙、丙分别为安全阀、 排气阀、压力表。 2在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确的顺序为( ) 溶化 调 pH 加棉塞 包扎 分装 称量 A B C D 答案 B 解析 培养基的配制顺序为称量溶化调 pH分装加棉塞包扎。 3下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是( ) A第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养
22、物 B每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种 C在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液 D划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染 操作者 答案 C 解析 平板划线操作中，接种环挑取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污 染培养物，以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种；划线结束仍需灼 烧接种环，是为了能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者；从第 二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。 4下列依次表示倒平板、接种的位置，以及划线法接种的路径示意图，其
23、中错误的是( ) 答案 D 解析 倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒 入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，防止空气中的杂菌污染，故 A 项正确；接种时，左 手将培养皿打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，故 B 项正确；划线时 要从上一次划线的末端开始进行，让菌种来源于上一次划线末端，故 C 项正确，D 项错误。 5下表所示为某微生物培养基的配方，请回答下列问题： 成分 含量 NaNO3 3 g K2HPO4 1 g KCl 0.5 g MgSO4 7H2O 0.5 g FeSO4 0.01 g C6H12O6 30 g H2O 1 000 mL 青霉素 0.1 万单位 (1)按照物理性质，该培养基属于 培养基。 (2)该培养基中的碳源是 。不论何种培养基，在各成分都溶化后分 装前，要进行的是调整 pH 和 ，倒平板时，一般需冷却至 左右，在 附近操作。 答案 (1)液体 (2)C6H12O6 灭菌 50 酒精灯火焰 解析 (1)该培养基中没有加入琼脂，属于液体培养基。 (2)C6H12O6为微生物提供碳源，培养基在分装前要调整 pH 和灭菌，倒平板时，一般需冷却至 50 左右，在酒精灯火焰附近操作。
