1、11 DNA 重组技术的基本工具学习目标 1.基因工程的概念、诞生和发展。2.DNA 重组技术所需三种基本工具的作用。3.基因工程中载体需要具备的条件。方式一 抗虫棉的研究开发是中国发展农业转基因技术，打破跨国公司垄断，抢占国际生物技术制高点的成功事例。抗虫棉的应用使棉铃虫得到了有效控制，使杀虫剂用量降低了70%80%，有效保护了农业生态环境，减少了农民喷药中毒事故，为棉花生产和农业的可持续发展做出了巨大贡献。师：要实现抗虫基因在棉花中的表达，提前要做哪些关键工作？生：要将抗虫基因切割下来；要将抗虫基因整合到棉花的 DNA 上。师：这里存在一个基因转移的实际问题，就是如何将控制抗虫的基因转入棉
2、花细胞的问题。师：中国有句俗语叫“没有金刚钻儿，不揽瓷器活儿” 。科学家们在实施基因工程之前，苦苦求索，终于找到了实施基因工程的三种“金刚钻儿” ，使基因工程的设想成为了现实。这三种“金刚钻儿”是什么？有什么特点和具体作用？下面我们就来学习这方面的内容。方式二 科学设想，能否让禾本科植物也能固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？能否让微生物产生人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？经过多年努力，科学家于 20 世纪70 年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。这一技术是在 DNA 分子水平上进行的，在微小的 DNA 分子上进行的操作，需要专用的工具。这些工具是什么？各自的作用是什么？让我们一起
3、来了解一下吧！一、基因工程的概念和诞生1基因工程的概念基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又称为 DNA 重组技术。2基因工程的诞生(1)理论基础DNA 是遗传物质的证明。DNA 双螺旋结构和中心法则的确立。遗传密码的破译：所有生物共用一套遗传密码。(2)技术支持基因转移载体的发现：质粒有自我复制能力，并且可以在细菌细胞间转移。工具酶的发现：陆续发现了多种限制酶、连接酶以及逆转录酶。DNA 合成和测序技术、体外重组技术的实现。重组 DNA 表达实验的成功。归纳总结1对基因工程
4、概念的理解操作环境 生物体外操作对象 基因操作水平 DNA 分子水平原理 基因重组结果 按照人类的需要定向改造生物的遗传特性2.基因工程的理论基础(1)几乎所有生物的 DNA 分子都具有相似的成分和结构，即都是由 4 种脱氧核苷酸形成规则的双螺旋结构，这为不同生物的 DNA 拼接提供了物质基础。(2)所有生物共用一套遗传密码，这为一种生物的基因在其他生物体内正常表达提供了可能。(3)基因是控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性，这为目的基因在受体细胞中的独立表达提供了可能。例 1 (2017洛阳校级月考)下列叙述符合基因工程概念的是( )A在细胞内将 DNA 进行重组，赋予生物新的遗传
5、特性B将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C用紫外线照射青霉菌，使其 DNA 发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其 DNA 整合到细菌 DNA 上答案 B解析 基因工程是在生物体外将 DNA 进行重组，赋予生物新的遗传特性，A 项错误；B项符合基因工程的概念；C 项属于诱变育种； D 项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。例 2 目前，科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列不是这一先进技术的理论依据的是( )A所有生物共用一套遗传密码B基因能控制蛋白质的合
6、成C兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的 DNA 都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则D兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先答案 D解析 题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的信使 RNA 上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A 项正确；基因是通过转录获得信使 RNA，进而控制蛋白质的合成，B 项正确；基因是有遗传效应的 DNA 片段，只要是双链 DNA 都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C 项正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D 项错误。方法链接 基
7、因重组的三种主要类型(1)减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间交叉互换，导致染色单体上的基因重新组合。(2)减数第一次分裂后期，随着非同源染色体的自由组合，非同源染色体上的非等位基因也自由组合。(3)人工操作导致的基因重组，即基因工程。二、基因工程操作的两种工具酶1限制性核酸内切酶“分子手术刀”来源 主要来自原核生物种类 约 4_000 种识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列特点切割特定核苷酸序列中的特定位点作用 断裂特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键结果 产生黏性末端或平末端2.DNA 连接酶“分子缝合针”(1)作用：将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶
8、切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)种类种类 来源 特点Ecoli DNA 连接酶 大肠杆菌只能“缝合”具有互补黏性末端的双链DNA 片段，不能“缝合”双链 DNA 片段的平末端T4DNA 连接酶 T4 噬菌体既可以“缝合”双链 DNA 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链 DNA 片段的平末端归纳总结 与 DNA 相关的五种酶的比较名称 作用部位 作用结果限制酶 磷酸二酯键 将 DNA 切成两个片段DNA 连接酶 磷酸二酯键 将两个 DNA 片段连接为一个 DNA 分子DNA 聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA (水解) 酶 磷酸二酯键 将 DNA 片段水解为
9、单个脱氧核苷酸解旋酶 碱基对之间的氢键将双链 DNA 分子局部解旋为单链，形成两条长链例 3 下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶) 及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，正确的是( )限制性核酸内切酶识别序列和切割位点限制性核酸内切酶识别序列和切割位点BamH G GATCC Kpn GGTAC CEcoR G AATTC Sau3A GATCHind GTY RAC Sma CCC GGG注：Y 表示 C 或 T，R 表示 A 或 G。A一种限制酶只能识别一种核苷酸序列B限制酶切割后一定形成黏性末端C不同的限制酶可以形成相同的黏性末端D限制酶的切割位点在识别序列内部答案 C解析 根据
10、表格内容可以推知，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，但不一定只能识别一种序列，如限制酶 Hind，A 项错误；限制酶切割后能形成黏性末端或平末端，如限制酶 Hind切割后露出平末端，B 项错误；不同的限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如限制酶 BamH和 Sau3A切割后露出的黏性末端相同，C 项正确；限制酶的切割位点可以位于识别序列的外侧，如 Sau3A，D 项错误。例 4 关于下图所示黏性末端的叙述，正确的是( )A与是由相同限制酶切割产生的BDNA 连接酶可催化与的连接C经酶切形成需要脱去 2 分子水DDNA 连接酶与 DNA 聚合酶均能作用于上述黏性末端答案 B解析 与的黏性末端相
11、同，但它们识别的碱基序列不同，应不是相同的限制性核酸内切酶切出来的， A 项错误；酶切获得 需要消耗 2 个水分子，C 项错误；DNA 聚合酶作用的是单个游离的脱氧核苷酸， D 项错误。方法链接 黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的判断方法将黏性末端或平末端之一旋转 180后，看它们是否是完全相同的结构。是，则为相同限制酶切割形成的；否，则为不同限制酶切割形成的。三、基因进入受体细胞的载体1种类：质粒、 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。2常用载体质粒(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA 之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状 DNA 分子。(2)质粒作为载体所
12、具备的条件及原因条件 原因稳定并能自我复制或整合到染色体 DNA 上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因 便于重组 DNA 的鉴定和选择无毒害作用对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤(3)作用作为运输工具，将目的基因导入受体细胞。质粒携带目的基因在受体细胞内大量复制。归纳总结1作为载体必须具备的条件(1)必须有一个至多个限制酶切割位点。(2)必须能在受体细胞中稳定存在并具备自我复制的能力，或整合到染色体 DNA 上，随染色体 DNA 同步复制。(3)必须有标记基因，便于筛选和鉴定。(4)对受体细胞无害。(5)载体的大小适
13、合，便于提取和在体外进行操作。2标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如下图：例 5 质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是( )A质粒在宿主细胞内都要整合到染色体 DNA 上B质粒是独立于细菌拟核 DNA 之外的小型细胞器C基因工程使用的质粒一定含有标记基因和复制原点D质粒上碱基之间数量存在 AGUC答案 C解析 基因工程使用的载体需有一至多个酶切位点，具
14、有自我复制的能力，有标记基因，对受体细胞安全，且分子大小适合。质粒进入宿主细胞后不一定都要整合到染色体 DNA上，如宿主细胞是细菌细胞则不需整合。质粒是小型环状双链 DNA 分子而不是细胞器，也不会有碱基 U。例 6 质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测 三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素
15、的培养基上的生长状况 能生长 能生长 能生长 不能生长 不能生长 能生长A.是 c；是 b；是 aB是 a 和 b；是 a；是 bC是 a 和 b；是 b；是 aD是 c；是 a；是 b答案 A解析 细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是 c；细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，故插入点为 b；细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为 a。易混辨析 细胞膜上的载体与基因工程中的载体
16、比较(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA) 、 噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车” ，把目的基因导入受体细胞。基因工程的基本工具限制性核酸内切酶(分子手术刀 )Error!DNA 连接酶分子缝合针 Error!载体分子运输车Error!1下列说法中不正确的有( )限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的 DNA 连接酶都是从原核生物中分离得到的 所有限制酶识别的核苷酸序列均由 6 个核苷酸组成 不同限制酶切割 DNA 的位点不同
17、 有的质粒是单链 DNAA BC D答案 B解析 限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，有很少量是来自真核生物酵母菌，错误；T 4DNA 连接酶来源于 T4 噬菌体(一种病毒) ，错误；EcoR、Sma限制酶识别的序列均为 6 个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由 4、5 或 8 个核苷酸组成，错误；不同限制酶切割 DNA 的位点不同，切割出不同的黏性末端或平末端，正确；所有的质粒都是双链的环状 DNA 分子，错误。2下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的( )A1 种 B2 种 C3 种 D4 种答案 C解析 图中为相同的平末端，可能由同一种限制酶切割所得，故图示四种末端至少是由 3
18、种限制酶作用产生的。3(2017广东深圳中学期末) 下列关于基因工程中的 DNA 连接酶的叙述不正确的是( )ADNA 连接酶的化学本质是蛋白质BDNA 连接酶能够连接两个 DNA 片段之间的磷酸二酯键C基因工程中可以用 DNA 聚合酶替代 DNA 连接酶D根据来源不同，DNA 连接酶可分为 Ecoli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶两大类答案 C解析 DNA 连接酶的化学本质是蛋白质，根据来源不同可分为 Ecoli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶两大类，DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片段之间的磷酸二酯键，而 DNA 聚合酶连接的是 DNA 片段与游离的脱氧核苷酸之间的磷
19、酸二酯键，因此在基因工程中不能用 DNA 聚合酶替代 DNA 连接酶，故选 C。4下图表示一项重要的生物技术，对图中物质 a、b、c、d 的描述，正确的是( )A通常情况下，a 与 d 需要用同一种限制酶进行切割Bb 能识别特定的核苷酸序列，并将 A 与 T 之间的氢键切开Cc 连接双链间的 A 和 T，使黏性末端处碱基互补配对Db 代表的是限制性核酸内切酶， c 代表的是 RNA 聚合酶答案 A解析 b 是限制性核酸内切酶，能识别特定的核苷酸序列并使 DNA 分子的每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，而不是使氢键断开；c 是 DNA 连接酶，能连接两个 DNA 片段。5(20
20、17陕西黄陵中学高二下期中) 番茄在运输和贮藏过程中，由于过早成熟而易腐烂。应用基因工程技术抑制某种促进果实成熟的激素的合成，可使番茄贮藏时间延长，培育成耐贮藏的番茄新品种。这种转基因番茄已于 1993 年在美国上市，请回答：(1)促进果实成熟的重要激素是_。(2)在培育转基因番茄的操作中，所用的“分子手术刀”是 _，基因的“分子缝合针”是_，基因的“分子运输车”是_。(3)与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是_。答案 (1)乙烯 (2) 限制性核酸内切酶( 或限制酶) DNA 连接酶 载体 (3)定向改变生物性状、育种周期短、克服远缘杂交不亲和的障碍(顺序不作要求)
21、解析 (1)促进果实成熟的重要激素是乙烯。(2)在培育转基因番茄的基因操作中，所用的基因的“分子手术刀”是限制酶，基因的“分子缝合针”是 DNA 连接酶，基因的“分子运输车”是载体。(3)通过基因工程来培育新品种的主要优点是能定向改变生物性状、育种周期短、克服远缘杂交不亲和的障碍。对点训练题组一 基因工程的概念和诞生1下列有关基因工程诞生的说法，不正确的是( )A基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的B工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能C遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据D基因工程必须在同物种间进行答案 D解析 基因工程可在不同物种间进行，它可打
22、破生殖隔离的界限，定向改造生物的遗传性状。2切取动物控制合成生长激素的基因，注入鲇鱼受精卵中，与其 DNA 整合后产生生长激素，从而使鲇鱼比同种正常鱼增大 34 倍。此项研究遵循的原理是( )A基因突变 B基因重组C细胞工程 D染色体变异答案 B解析 将动物控制合成生长激素的基因注入鲇鱼受精卵中，通过 DNA 复制、转录、翻译合成特定的蛋白质，表现出特定的性状，此方法依据的原理是基因重组。3(2017泉州泉港一中高二下期中)1987 年，美国科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明( )萤火虫与烟草植物的 DNA 结构
23、基本相同 萤火虫与烟草植物共用一套密码子 烟草植物体内合成了荧光素 萤火虫和烟草植物合成蛋白质的原理基本相同A和 B和C和 D答案 D解析 “美国科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞” ，说明萤火虫的荧光素基因与烟草细胞的 DNA 进行了重组，也说明它们的 DNA 结构基本相同，正确；“获得高水平的表达” “长成的植物通体光亮” ，说明在烟草植物细胞中合成了萤火虫的荧光素，这个事实说明萤火虫与烟草植物共用一套密码子，萤火虫和烟草植物合成蛋白质的原理基本相同，都要经过转录和翻译两步，因此正确。题组二 基因工程操作的相关工具酶4(2017成都七中期中)以下几种酶中与磷酸二酯键的形成或断裂有关
24、的有几种( )限制性核酸内切酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 解旋酶 DNA 酶A两种 B三种 C四种 D五种答案 C解析 限制性核酸内切酶和DNA 酶都与磷酸二酯键的断裂有关；DNA 连接酶和DNA 聚合酶都与磷酸二酯键的形成有关；解旋酶与氢键断裂有关。5(2017辽宁五校高二下学期期中) 下列关于基因工程工具酶的说法，正确的是( )AEcoli DNA 连接酶既能够连接平末端，也可以连接黏性末端B每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，体现了酶的专一性CDNA 连接酶连接的是碱基间的氢键D限制酶、DNA 连接酶和质粒是基因工程常用的工具酶答案 B解析 E coli DN
25、A 连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，A 项错误；每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割 DNA 分子，体现了酶的专一性，B 项正确；DNA 连接酶连接的是两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，C 项错误；限制酶和DNA 连接酶是基因工程常用的工具酶，但质粒是载体，不是工具酶，D 项错误。6据图判断，下列有关几种酶功能的叙述错误的是( )A限制性核酸内切酶可以切断 a 处BDNA 聚合酶可以连接 a 处C解旋酶可以使 b 处解开DDNA 连接酶可以连接 c 处答案 D解析 a 处指的是相邻两个脱氧核苷酸之间的脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键，而 c 处指的是一个脱氧核苷酸内的脱
26、氧核糖和磷酸之间的化学键，DNA 连接酶不能连接此化学键。题组三 基因工程中的载体7质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )A质粒只分布于原核细胞中B在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体 DNA 上才会随后者的复制而复制D质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组 DNA 的鉴定选择答案 D解析 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物酵母菌细胞内也有分布，A 项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B 项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合到染色体
27、DNA 上，随染色体 DNA 进行同步复制，C 项错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因，D 项正确。8下面是四种不同质粒的示意图，其中 ori 为复制必需的序列，Amp r 为氨苄青霉素抗性基因，Tet r 为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组 DNA 的细胞，应选用的质粒是( )答案 C解析 A 项破坏了复制必需的序列； B 项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长；C 项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄
28、青霉素培养基上生长；D 项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏，能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长。综合强化9某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因 a，通过基因工程的方法，将基因 a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现 Amy 在成熟块茎细胞中存在。下列有关这一过程的叙述不正确的是( )A获取基因 a 的限制酶的作用部位是图中的B连接基因 a 与载体的 DNA 连接酶的作用部位是图中的C基因 a 进入马铃薯细胞后，可随马铃薯 DNA 分子的复制而复制，传给子代细胞D通过该技术人类实现了定向改造马铃薯的遗传性状答案 B解析 限制酶和 DNA 连接酶的作用
29、部位都位于，但两者作用相反；载体具有在宿主细胞中复制的能力，与目的基因结合后，目的基因也会在宿主细胞中一起复制；基因工程的目的就是定向改造生物的遗传性状。10(2018河南周口中英文学校高二月考) 关于基因工程，下列说法正确的有( )重组 DNA 技术所用的工具酶是限制酶、DNA 连接酶和载体 基因工程是在 DNA 分子水平上进行的设计和施工 限制酶的切口一定是 GAATTC 碱基序列只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物体上质粒是基因工程中唯一用作运载目的基因的载体A2 项 B3 项 C4 项
30、D5 项答案 A解析 重组 DNA 技术所用的工具酶是限制酶、DNA 连接酶，载体不属于工具酶，错误；基因工程又称 DNA 重组技术，是在 DNA 分子水平上进行的设计和施工，正确；一种限制酶只能识别某种特定的核苷酸序列，其具有特异性，所以限制酶的切口不都是 GAATTC碱基序列，错误；即使目的基因能进入受体细胞，也不一定可以成功表达，还要考虑基因的插入位置等因素，所以需要检测和鉴定，错误；一种限制酶只能识别某种特定的核苷酸序列，即具有特异性，错误；基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和
31、生物产品，因而可以通过基因工程将一种生物的优良性状移植到另一种生物体上，正确；基因工程常用的载体有质粒、 噬菌体的衍生物、动植物病毒等，错误。11(2017重庆八中期中)如图所示为一种限制酶切割 DNA 分子的示意图，请据图回答：(1)这种限制酶的切点是_，结果是形成两个 _末端，这两个末端的特点是_。(2)图中 DNA 分子被该种限制酶切割后形成的两个末端是_。(3)如果 G 发生突变， _(填“可能”或“不可能”)导致限制酶不能识别切割位点。答案 (1)GA 之间 黏性 碱基能够互补配对(2) 和 (3)可能G CTTAA AATTC G解析 由题意知，该限制酶识别的核苷酸序列是 GAAT
32、TC，专一切口是 G 和 A。切出的两个黏性末端碱基能够互补配对。12(2016全国乙，40 节选) 某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相应的基因失活(Amp r 表示氨苄青霉素抗性基因，Tet r 表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用 BamH酶切后，与用 BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备
33、的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于_。答案 (1)能自我复制、具有标记基因、含一个至多个限制酶切割位点( 答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生
34、长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒 ) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素(3)受体细胞解析 (1)作为载体必须具备如下特点：能自我复制，从而在受体细胞中稳定保存； 含标记基因，以供重组 DNA 的鉴定和选择；具一个至多个限制性核酸内切酶切割位点以便外源 DNA 片段插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有 Ampr 的大肠杆菌才能够生长。而 Ampr 位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有 Ampr，因而能在培养基
35、中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的 Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成 DNA 复制。13目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322 质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。请据图回答下列问题：(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_。(2)pBR322 分子中有单个 EcoR限制酶作用位点，EcoR只能识别序列GAATTC，并只能在 G 和 A 之间切割。若在某目的基因的两
36、侧各有 1 个 EcoR的切点，请画出目的基因两侧被限制酶 EcoR切割后所形成的黏性末端：_。(3)pBR322 分子中另有单个的 BamH限制酶作用位点，现将经 BamH处理后的质粒与用另一种限制酶 Bgl处理得到的目的基因，通过 DNA 连接酶作用恢复 _键，成功获得了重组质粒，说明_。(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无 Ampr 和 Tetr 的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型
37、是_，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。答案 (1)筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞(2)如图所示：目的基因G AATTCG AATTCCTTAA GCTTAA G(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamH和 Bgl)切割得到的黏性末端相同(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 既能抗氨苄青霉素，又能抗四环素的 pBR322 质粒解析 (1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选( 鉴别)目的基因是否导入受体细胞。(2)同一种限制酶切割 DNA 分子产生的黏性末端相同，图见答案。(3)DNA 连接酶催化两个 DNA 片段形成磷酸二酯键；而通过 DNA 连接酶作用能将两个 DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(Bam H和 Bgl)切割得到的 DNA 片段，其黏性末端相同。(4)由题意知：由于有图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶 BamH作用后，标记基因 Tetr 被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是既能抗氨苄青霉素，又能抗四环素的 pBR 质粒，而不是重组质粒(重组质粒的四环素抗性基因被切断 )。
