1、第第 1 课时课时 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离 学习目标 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌 的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。 一、微生物培养的基本条件 1.微生物 (1)概念：结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。 (2)用途：许多种抗生素来源于放线菌和霉菌；酒由酵母发酵产生；腐乳由红曲霉和毛霉发酵 制成；微生物能用于治理环境污染，在新能源领域也将发挥巨大作用。 2.培养基 (1)概念：培养基是微生物生存的环境和营养物质。 (2)分类：培养基按物理性质常可分为固体培养
2、基和液体培养基，一般都含有水、碳源、氮源 和无机盐四类营养物质，另外还需满足微生物生长对 pH、特殊营养物质和氧气的要求。通常 细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制， 还要加入一定量的氯化钠以维持一定的渗透压； 霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。 (3)酸碱性：细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，霉菌要求在中性偏酸的环境中生长；因 此，在制备培养基时需调节培养基的酸碱度。 特别提醒 有关培养微生物所需营养的三点提醒 (1)不同微生物对营养的需求不同，所以培养不同的微生物所需要的营养可能不同。 (2)对异养微生物来说，含 C、H、O、N 的有机物既是碳源又是氮源、能源。 (3)
3、培养微生物时营养物质要协调。营养物质过少不能满足微生物的营养需要，过多对微生物 的生长有抑制作用。 3.灭菌操作 (1)常见灭菌方法 对于培养皿、试管、三角瓶、镊子等常采用高压蒸汽灭菌法灭菌。 对于不能加热灭菌的化合物，如尿素等，只能用 G6 玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用 前也要在 121 下用纸包好灭菌。 实验操作过程中，一般采用灼烧的方法对接种环进行灭菌。 (2)高压蒸汽灭菌操作的要求 灭菌前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好，在 121 下灭菌 15 min，实验过程中所需的棉 花不能用脱脂棉，因为其易吸水，吸水后容易引起污染。 如培养基中有葡萄糖，为防止其分解碳化，要用 500_g/c
4、m2压力(90 以上)灭菌 30 min。 归纳总结 1.培养基的类型 划分 标准 培养基种类 特点 用途 按物理 状态 液体培养基 不加凝固剂 扩大培养或工业生产 半固体培养 基 加少量凝固剂而呈半固体状态 观察微生物的运动、 分类 鉴定 固体培养基 加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等 微生物分离、鉴定、活菌 计数、保藏菌种 按功能 选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑 制或阻止其他微生物生长 培养分离特定的微生物 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中 加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物 按化学 成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 合成培养基 培
5、养基的成分已明确 分类、鉴别 2.无菌操作，既包括各种器皿必须是无菌的，也包括各种培养基必须是无菌的，同时还要求 在接种时，不能带有其他杂菌，所以在实验过程中，应时刻保持这种无菌意识。 例 1 (2018 浙江学军中学月考)下列关于培养基的说法，不正确的是( ) A.培养基配制的原则一是目的要明确，二是营养要协调、三是 pH 要适宜 B.配制培养基时还要考虑微生物对特殊营养物质的要求，否则微生物可能不能生长或生长极 差 C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基 D.选择培养基是允许特定种类微生物生长，但抑制或阻止其他微生物生长的培养基 答案 C 解析 培养基配制的原则一是目的要明确，弄清培
6、养基的所属类型，二是营养要协调，符合 目的微生物的生长需求，三是 pH 要适宜，A 正确；有的微生物对营养物质具有特殊的要求， 配制培养基时还要考虑微生物对特殊营养物质的要求， 否则微生物可能不能生长或生长极差， B 正确；固体培养基中去除凝固剂(如琼脂、明胶等)即可制成液体培养基，C 错误；选择培养 基是指在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的 培养基，目的是从众多微生物中分离所需要的微生物，D 正确。 例 2 (2019 温州高二检测)下列关于灭菌的叙述，正确的是( ) A.用于细菌等微生物培养的培养基都必须用高压蒸汽灭菌锅灭菌 B.锥形瓶、培养皿、移液
7、管等器具的高压蒸汽灭菌时间一般为 15 min(121 条件下) C.超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌 30 min 即可 D.灭菌后的培养基、器具就已经达到了完全无菌 答案 B 解析 培养基通常可以进行高压蒸汽灭菌，若培养基中有碳酸氢钠、尿素等高温易分解的成 分，就不能用此方法，A 项错误；超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌 30 min，同时还需打开 过滤风，C 项错误；灭菌后的培养基、器具不一定达到了完全无菌，而且要防止二次污染， D 项错误。 方法技巧 三种常用灭菌方法的比较 灭菌方法 适用材料或用具 灭菌条件 灭菌时间 灭菌后处理 高压蒸汽 灭菌 培养基、玻璃器皿等 121 ， 1 kg/
8、cm2 压力(若培养基 中含有葡萄糖， 为防止其碳化， 90 以上，500 g/cm2压力) 15 min(若含有 葡萄糖，灭菌时 间 30 min) 实验用具在60 80 烘箱中烘 干；培养基冷却 待用 灼烧灭菌 接种环、 接种针或其他 金属用具；玻璃刮刀 在酒精灯火焰的 充分燃烧层灼烧 烧红(或玻璃刮 刀上的酒精燃 尽) 防止过热杀死目 的菌种，冷却后 使用 过滤灭菌 不能加热灭菌的化合 物，如尿素培养基等 G6 玻璃砂漏斗 过滤 尿素滤液过滤 完毕 玻璃砂漏斗用 1 mol/L 的 HCl 浸 泡，抽滤去酸后 蒸馏水洗至中 性，干燥后保存 二、细菌的培养与分离 1.细菌的分离方法 (1)
9、划线分离法：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作。由于划线过程中，接种环上 的菌液逐渐减少，因此划线最后部分的细菌间距离加大，经过培养可获得单菌落。 (2)涂布分离方法：用此法分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释 10 5107 倍。取 0.1 mL 稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上， 然后进行培养。通常以每个培养皿中有 20 个以内的单菌落最为合适。 (3)两种分离法的比较：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂 些。 2.大肠杆菌的培养和分离 (1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用 LB 液体培养基扩大培养大
10、肠杆菌，培 养后再在 LB 固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。 (2)实验步骤 培养基灭菌 倒平板 接种 划线分离 培养观察 菌种保存 将 50 mL LB 液体培养基和 50 mL LB 固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌 将培养基分别倒入 4 个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面 在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养 12 h 用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平 板上连续划线，盖好培养皿 将培养皿倒置(盖在下面)，放在 37 恒温培养箱中培养 1224 h 后，可 看到在划线的末端出现不连续的单个菌落 在无菌操作下将单
11、菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 培养 24 h 后，置于 4 冰箱中保存 归纳总结 1.划线分离法的操作步骤 2.涂布分离法的操作步骤 (1)操作图示 (2)相关说明 将分别盛有 9 mL 水的 6 支试管灭菌，并按 101106的顺序编号。 用移液管吸取 1 mL 培养的菌液， 注入 101倍稀释的试管中。 用手指轻压移液管上的橡皮头， 吹吸 3 次，使菌液与水充分混匀。 从 101倍稀释的试管中吸取 1 mL 稀释液， 注入 102倍稀释的试管中， 重复步的混匀操作。 依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。 例3 (2018 浙江效实中学期中)如图表示利用划线分离法分离和纯
12、化大肠杆菌的部分操作步 骤，下列相关叙述正确的是( ) A.步骤倒平板操作时，只需要在超净台中不需要在酒精灯火焰旁进行 B.步骤使用的工具是接种环，接种前需在明火上烧红后冷却 C.步骤恒温培养箱培养后的结果说明整个过程中蘸取菌液 4 次 D.该方法使单菌落更容易分开，但操作复杂些 答案 B 解析 即使在超净台中，步骤倒平板操作时，也需要在酒精灯火焰旁进行，A 错误；步骤 中接种环都需要进行灼烧灭菌，即在火焰上灼烧，待冷却后才可以蘸取菌液进行平板划 线，B 正确；划线分离法中只蘸取菌液 1 次，C 错误；平板划线法操作简单方便，但是单菌 落不易分离，D 错误。 例 4 (2018 嘉兴高二检测)
13、图甲、图乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题： (1)图甲是利用_法进行微生物接种，图乙是利用_法进行微生物接 种。 (2)这两种方法所用的接种工具分别是_和_；在接种过程中对这两种 接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是_和酒精消毒。 (3)下图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是_(填“图甲”或 “图乙”)。 (4)下列关于微生物培养和分离的叙述不正确的是_。 A.利用图乙所示接种法可以分离微生物但不能对微生物进行计数 B.接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落 C.利用图甲所示接种法接种过程中，每次划线前后都要对接种环进行灭菌 D.图乙所示接种法中使用的
14、接种工具须保存在 70%的酒精中 答案 (1)划线分离 涂布分离 (2)接种环 玻璃刮刀 灼烧灭菌 (3)图乙 (4)A 解析 (1)分析图示可知，图甲为用划线分离法进行微生物接种，图乙是利用涂布分离法进行 微生物接种。(2)前者利用的工具是接种环，后者利用的工具是玻璃刮刀。对于接种环而言， 灭菌的操作方法是灼烧，玻璃刮刀通常浸泡在 70%酒精中消毒。(3)题图中，菌落均匀分布， 分离效果较好，是涂布分离法操作的结果。(4)采用涂布分离法，可以通过培养基表面的菌落 数，对微生物进行计数，但采用该方法计数通常比实际菌落数偏低，A 项错误。 方法技巧 划线分离法与涂布分离法的比较 项目 划线分离法
15、 涂布分离法 原理 连续划线。 由于划线后， 线条末端细菌 的数目比线条起始处要少， 每次划线从 上一次划线的末端开始， 能使细菌的数 目随着划线次数的增加而逐步减少， 最 终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释， 然后将 不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固 体培养基的表面， 进行培养。 在稀释度 足够高的菌液里， 聚集在一起的微生物 将被分散成单个细胞， 从而能在培养皿 表面形成单个菌落 操作工具 接种环 玻璃刮刀 使用要求 用时需灼烧 放置在 70%酒精中，用时需灼烧 特点 操作简单，但是单菌落不易分离 操作复杂，单菌落易分离 相同点 使聚集在一起的微生物分散成单个细胞
16、， 从而能在培养基表面形成单个的菌落， 以便于纯化菌种 1.判断正误： (1)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有划线分离法和涂布分离法( ) (2)在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌( ) (3)单菌落的分离是消除杂菌污染的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株最简便的方法之一 ( ) (4)接种环在每次转移菌种之前都需要进行高压蒸汽灭菌，以杀灭接种环上的杂菌( ) (5)根据微生物对营养物质的需求，配制相应的培养基，如“细菌喜荤，霉菌喜素”，经高压 蒸汽灭菌之后还要调节 pH( ) (6)有些化合物不能加热，如尿素等需采用玻璃砂漏斗进行过滤灭菌，常用的有 G5 或 G6 玻
17、 璃砂漏斗( ) (7)培养微生物的培养基分装到培养皿后进行灭菌( ) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 2.(2019 西湖区高二检测)金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食 物中毒。下列有关接种金黄色葡萄球菌的实验叙述错误的是( ) A.将灼烧的接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位 B.取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌 C.对接种环进行灼烧处理 D.接种后还要将试管口灭菌加塞 答案 A 解析 接种环伸入试管后应先接触未长菌的部位，待接种环冷却后再接触长菌多的部位。 3.(2018 浙江效实中学检测)在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养
18、结果(乙)如图 所示。有关叙述错误的是( ) A.接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌 B.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落 C.接种过程中至少需要对接种环灼烧 5 次 D.甲中 a 区域为划线的起始位置 答案 D 解析 培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，A 项正确；菌液经过连续划线，菌液中的菌体越 来越少，最后容易形成单菌落，B 项正确；在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，因此按 照图中划线顺序(dcba)，整个划线过程中至少需要对接种环灼烧 5 次，C 项正确；每次 划线的菌种来自上一区域的末端，因此划线的起始区域菌落多，由图乙可知，甲中 d 区域菌 落多，为划线的起始位置，D 项错误。
19、4.下列关于微生物的培养和分离的叙述中，不正确的是( ) A.细菌能在液体培养基中以二分裂方式迅速扩增 B.噬菌体或大肠杆菌可在蛋白胨培养基中增殖 C.灭菌的目的是消灭与培养菌竞争的杂菌 D.涂布分离法分散细菌得到单菌落的效果更好 答案 B 解析 噬菌体属于病毒，营寄生生活，不能在蛋白胨培养基中增殖。 5.大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群， 每克粪便中大约含有 109个， 且能够与致病菌混 杂生长。如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌， 因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。请据此回答下列问题： (1)测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目，常用涂
20、布分离法。该方法首先配制 LB_ 培养基，进行高压蒸汽灭菌后冷却至 60 ，在_旁倒在培养皿中形成平板；对奶 茶样品进行一定倍数的稀释，取 0.1 mL 奶茶稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用 _涂布在培养基平面上，然后进行培养；观察统计培养皿中_数目；该数据 比实际数值要_(填“高”或“低”)，原因是_ _。 实验完成后需要对培养基进行_处理，然后才能倒掉。 (2)若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养，则需配制 LB_培养基，灭菌后，将 _在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中，在 适宜环境中培养_h 即可。 答案 (1)固体 酒精灯火焰 玻璃刮刀 菌落 低 培
21、养基中可能有两个或多个细菌紧挨 在一起，共同形成一个菌落 灭菌 (2)液体 接种环 12 解析 (1)微生物的分离通常用固体培养基。为防止杂菌污染，要在酒精灯火焰旁倒平板。在 用涂布分离法分离细菌时，为了使细菌均匀涂布在固体培养基上，常用玻璃刮刀把菌液涂布 在培养基上，通过观察菌落数推算细菌数目。培养基中可能有两个或多个细菌紧挨在一起， 共同形成一个菌落，因此观察到的菌落数可能比实际菌落数低。为了防止实验菌污染环境， 实验完成后需要对培养基进行灭菌处理，然后才能倒掉。(2)对微生物进行扩大培养，通常使 用 LB 液体培养基。一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在酒精灯火焰上 烧红后冷却，然后蘸取带菌的培养物，接种到新的培养基中，在液体培养基中，适宜条件下 培养 12 h。
