1、第第 4 课时课时 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 学习目标 1.尝试用吸附法制作固定化 -淀粉酶。 2.运用固定化 -淀粉酶进行淀粉水解的测 定。3.说明酶固定化的方法及制作原理。4.通过此实验探讨固定化酶的应用价值。 一、固定化技术的基础知识 1.酶 (1)作用：酶是生物体内各种化学反应的催化剂。 (2)特点：它有高度的专一性和高效性。 2.固定化酶 (1)概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶 活性的制剂。 (2)方法：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。教材实验中用的是吸附法。 特别提醒 图示解读：酶固定化
2、的方法 是吸附法：是将酶吸附到载体表面。 是共价偶联法：是将酶通过共价键结合到载体的表面。 是交联法：通过把酶交互连接、相互结合而将酶固定。 是包埋法：是将酶或者细胞包埋在细微的网格里。 3.将酶改造成固定化酶的原因：酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。 4.固定化酶作用的机理：将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。 归纳总结 直接使用酶和固定化酶的比较 项目 直接使用酶 固定化酶 酶的种数 一种或几种 一种 常用载体 石英砂、高岭土、皂土、硅胶、凝胶 制作方法 化学结合法固定化、 物理吸附法固定化 催化反应 单一或多种 单一 反应底物 各种物质(大分子、小分子) 各
3、种物质(大分子、小分子) 缺点 对环境条件非常敏感，易失活；难回 收，成本高，影响产品质量 不利于催化一系列的酶促反应 优点 催化效率高、耗能低、污染低 既能与反应物接触，又能与产物分 离；可以反复利用 例 1 (2019 嘉兴一中月考)下列不属于固定化酶在使用时的特点的是( ) A.有利于酶与产物分离 B.可以被反复利用 C.能自由出入依附的载体 D.一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应 答案 C 解析 固定化酶由于酶被固定在不溶性的载体上， 很容易与产物分离， 同时酶也能反复使用， 这是固定化酶的主要优点；通常固定化酶的种类单一，所以不能催化一系列酶促反应。 例 2 下列与固定化酶
4、相关的叙述中正确的是( ) A.固定化酶是将水不溶性酶固定于某种介质上，使之成为易溶于水，而又具酶活性的制剂 B.将固定化酶装柱，当酶流过该柱时，可催化柱内底物转变为产物 C.酶固定的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等 D.固定化酶的缺点是酶在水溶液中很不稳定，且易与产物混在一起不易分离 答案 C 解析 固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水 而又有酶活性的制剂；与普通酶相比，固定化酶易与产物分离，且固定化酶反应柱中酶已被 固定，不能从柱内流出；酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。 二、-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验 1.
5、枯草杆菌的 -淀粉酶的固定化 (1)枯草杆菌的 -淀粉酶作用的条件：最适 pH 为 5.57.5；最适温度为 5075_。 (2)固定化方法用吸附法将 -淀粉酶固定在石英砂上。 在烧杯中将 5 mg -淀粉酶溶于 4 mL 蒸馏水中，再加入 5 g 石英砂，不时搅拌，30 min 后， 装入 1 支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约 4 mL)。用 10 倍体积的蒸 馏水洗涤注射器以除去未吸附的游离淀粉酶。 (3)淀粉水解作用的检测原理 淀粉 -淀粉酶 糊精 -淀粉酶 麦芽糖 糖化 淀粉酶 葡萄糖 遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色 2.-淀粉酶固定化实验步骤 固定化淀粉酶，装
6、入注射器中 以0.3 mL/min的流速滴加淀粉溶液过柱 流出5 mL淀粉溶液后接收0.5 mL流出液 滴加KII2溶液，观察颜色，用水稀释1倍后再观察颜色 以10倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化柱，放置在4 冰箱中，几天后重复上述实验 3.实验结果 归纳总结 1.图示解读：-淀粉酶的固定化反应柱示意图(如图所示) (1)-淀粉酶的固定化的介质是石英砂，方法是吸附法。 (2)过程和原理：将 -淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使 淀粉水解成糊精。 (3)用淀粉指示剂测试，若流出物呈红色，表明有糊精生成。 2.两次洗涤的作用 (1)-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验过程
7、中，涉及两次对固定化酶柱的洗涤，第 一次是 -淀粉酶的固定化时，目的是洗去未吸附的游离的 -淀粉酶。 (2)第二次洗涤是在实验结束时，目的是清除未反应的淀粉和产物以便于下次固定化酶柱的继 续使用。两次洗涤都使用 10 倍柱体积的蒸馏水对固定化酶柱进行洗涤。 例 3 (2018 嘉兴高二检测)下列有关淀粉水解作用检测的叙述，错误的是( ) A.实验后，反应柱可常温保存 B.正常情况下，向流出液中滴加 KII2溶液呈红色 C.实验后，用蒸馏水洗涤反应柱，可洗去未反应的淀粉和产物糊精 D.实验中，向反应柱中滴加淀粉溶液宜慢，使淀粉溶液以 0.3 mL/min 的流速过柱 答案 A 解析 实验后反应柱
8、应低温(4 )保存，以延长酶的寿命。 例 4 如图为固定化酶反应柱的示意图，请回答下列问题： (1)将 -淀粉酶溶于水中，再加入石英砂，不时搅拌，这样 -淀粉酶就可以固定在石英砂上。 这种固定化的方法称为_。30 min 后，装入如图所示的反应器中，构成固定 化酶反应柱，并用 10 倍柱体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是_。洗涤 时，蒸馏水流速_(填“能”或“不能”)过快。 (2)实验时，将此反应柱固定在支架上，用滴管滴加可溶性淀粉溶液，并以 0.3 mL/min 的流速 过柱， 控制流速的目的是_。 在流出 5 mL 后接收 0.5 mL 流出液，加入 12 滴_， 观察颜色。为了使观察
9、到的颜色变化明显，可_后再观察。如果溶液呈红色，说明淀 粉水解成为_。 (3)实验后， 用 10 倍柱体积的蒸馏水洗涤此反应柱， 洗涤的目的是_。 洗涤后，放置在 4 冰箱中保存。几天后，可重复使用。 (4)一段时间后，某同学从冰箱中取出此反应柱，重复上述实验，却没有得到相同的结果，试 分析可能的原因：_ _。 答案 (1)吸附法 除去未吸附的游离的酶 不能 (2)保证酶与底物充分反应 KII2溶液 稀释 1 倍 糊精 (3)除去反应物及产物 (4)酶已 经失活或再次操作时相应的反应条件(如温度)不合适等 解析 (1)酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等，本题中为吸附法。构 成
10、固定化酶反应柱后，用蒸馏水洗涤是为了除去未吸附的一些游离的酶，在洗涤时蒸馏水流 速不能过快，流速为 1 mL/min。(2)以相对较慢的速度使淀粉溶液流过反应柱，可以让吸附着 的酶与底物充分反应。根据 KII2溶液与淀粉反应呈蓝色，与糊精反应呈红色的原理来鉴定 反应情况。 (3)实验完成后还需要对反应柱进行洗涤， 以除去参与反应的反应物及生成的产物， 以便重复使用。(4)一段时间后重复使用得不到相同的结果，排除反应物本身的问题，肯定是 酶出了问题，可能这些酶已经失活或再次操作时相应的反应条件(如温度)不合适等。 1.判断正误： (1)固定化酶可反复永久使用( ) (2)固定化酶技术所用的固定载
11、体一般为液相的( ) (3)反应物对固定化酶的活性没有影响( ) (4)固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离，提高了产物品质( ) (5)不管是固定化酶柱还是固定化悬浮体，回收后，在一定条件下贮存，还可以利用( ) (6)固定化酶可反复多次利用，节约了经济成本( ) (7)向亲和层析洗脱液中加 KII2溶液呈红色( ) (8)实验使用的 -淀粉酶的最适 pH 为 5.57.5，最适温度为 5075 ( ) (9)糊精遇碘显蓝色，淀粉遇碘显红色( ) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 2.(2018 浙江吴越联盟联考)在合适条件下，将果胶酶与海藻酸
12、钠混合后，滴加到一定浓度的 钙离子溶液中，使液滴形成凝胶固体小球。该过程是对酶进行( ) A.吸附 B.包埋 C.装柱 D.洗涤 答案 B 解析 分析题意可知，果胶酶在一定浓度的钙离子溶液中形成凝胶固体小球，说明凝胶固体 小球对果胶酶进行了包埋，B 项符合题意。 3.下列关于固定化酶和一般酶制剂应用效果的说法，错误的是( ) A.固定化酶生物活性强，可永久使用 B.一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高 C.一般酶制剂参加反应后不能重复利用 D.固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量 答案 A 解析 固定化酶是将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与底物接触，又能与产物分离。
13、 同时，固定在载体上的酶还可以反复利用，降低成本，产物中也不含酶，提高了产品的纯度； 固定化酶虽可以多次利用，但不可永久使用。 4.淀粉在各种酶的作用下会依次水解，不同阶段的水解产物遇到指示剂会出现不同的显色反 应，下列选项中属于 -淀粉酶的固定化实验中的反应产物和显色现象的是( ) A.淀粉遇碘显蓝色 B.糊精遇 KII2溶液显红色 C.麦芽糖遇碘不显色 D.葡萄糖遇本尼迪特试剂显红黄色 答案 B 解析 该过程所依据的原理是淀粉流经 -淀粉酶固定化酶柱时，淀粉被酶水解成了糊精，而 糊精遇到 KII2溶液显红色。所以 A、C、D 选项中的反应产物都是错误的，不是淀粉、麦 芽糖、葡萄糖，而是糊精
14、。只有选项 B 正确。 5.在 20 世纪 50 年代，酶已经大规模地应用于各个生产领域，到了 70 年代又发明了固定化酶 技术。请回答下列相关问题： (1)固定化酶技术将酶固定在_上，使酶既能与_接触，又能与 _分离，同时固定在载体上的酶还能_。常用的固定方法有吸附法、共价 偶联法、交联法和包埋法等。 (2)“-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”实验中： -淀粉酶固定在_上，使用了上图中的方法_(填号码及名称)。 实验中，用滴管滴加淀粉溶液时，使淀粉溶液以_的流速过固定化酶柱，目的是 _。 灌注了固定化酶的注射器在使用完后要_洗涤固定化柱，并放置在 _中保存。 答案 (1)不溶于水的载体
15、反应物 产物 反复利用 (2)石英砂 乙、 吸附法 0.3 mL/min 使淀粉充分与酶接触 用 10 倍柱体积的蒸馏水 4 冰箱 解析 (1)固定化酶技术将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物 分离，同时固定在载体上的酶还能反复利用。 (2)-淀粉酶固定在石英砂上，使用了图乙吸附法；用滴管滴加淀粉溶液时，使淀粉 溶液以 0.3 mL/min 的流速通过固定化酶柱，目的是使淀粉充分与酶接触；灌注了固定化酶 的注射器在使用完后要用 10 倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化柱，并放置在 4 冰箱中保存。 6.(2018 金华十校期末调研)回答与“-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测”有
16、关的问题： (1)在酶的固定化时，共价偶联法比吸附法对 -淀粉酶活性的影响更_(填“大”或 “小”)。 (2)实验室常用枯草芽孢杆菌来制备 -淀粉酶，枯草芽孢杆菌的 -淀粉酶的最适 pH 范围是 _。 (3)在固定化 -淀粉酶水解淀粉作用的检测实验中，固相淀粉酶水解淀粉的鉴定实验结果为： 淀粉溶液加指示剂呈蓝色；_加指示剂呈红色。 (4)枯草芽孢杆菌也是制备蛋白酶的良好原料，为筛选枯草芽孢杆菌的蛋白酶高产菌株，将分 别浸过不同菌株(ae)的分泌物提取液及无菌水(f)的无菌圆纸片置于含某种高浓度蛋白质的 平板培养基表面；在 37 恒温箱中放置 23 天，结果如下图。若需要保存 a 菌株，可将其 接种至斜面上， 培养后置于_中保存。 菌株 b 提取物周围没有形成明显清晰区的原因： _； _。 答案 (1)大 (2)5.57.5 (3)亲和层析洗脱液 (4)4 冰箱 不能合成蛋白酶或合成的蛋白酶量不足 合成的蛋白酶不分泌或分泌量不足 分泌的蛋白酶活性低(任意答出两点)
