1、第10课时 分子生物学技术,第四章 生物化学与分子生物学技术实践,学习导航 1.结合教材了解PCR技术的基本操作。 2.理解PCR扩增DNA片段的原理。 3.结合教材，尝试进行目的DNA片段的体外扩增。 重难点击 1.了解PCR技术的基本操作。 2.理解PCR的原理。,一、使用PCR仪的安全措施和PCR反应程序,二、目的DNA片段的体外扩增与鉴定,内容索引,当堂检测,一、使用PCR仪的安全措施和PCR反应程序,1.DNA分子的结构 (1)写出各个标号的名称： ； ； ； ； ； ； ； ； ； 。,基础梳理,胞嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶,脱氧核糖,磷酸基团,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,氢键,碱基对
2、,一条脱氧核苷酸链,(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将DNA的羟基末端称为3端，将磷酸基团的末端称为5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。 答案 左链上5端，下3端； 右链上3端，下5端。,答案,2.细胞内DNA复制条件分析,两,脱氧核苷酸,DNA双螺旋,合成DNA子链,ATP,3端,3.PCR技术 (1)概念：在 快速扩增 的技术称为PCR技术。 (2)物质条件： 、 、 、 。 (3)PCR反应的过程及结果 PCR反应程序 a. ：在94 高温下，作为模板的 解旋成为 。 b. ：反应体系的温度降至 ，引物与作为模板的单链DNA上的 相互配对。,体外
3、,特定基因或DNA序列(目的DNA片段),DNA模板,四种脱氧核苷酸,TaqDNA聚合酶,引物,变性,双链DNA,单链DNA,退火(复性),55 ,特定部位,c. ：反应体系的温度回升到 ，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的 。 结果 a.PCR扩增一般要经历三十多次循环，每次循环都包括_三步。 b.两引物之间的固定长度的DNA序列呈 扩增。,延伸,72 左右,DNA双链,变性、退火、,延伸,指数,问题探究,1.PCR原理 PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。
4、答案 不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。,答案,2.PCR反应过程 (1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？ 答案 PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。 (2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。 答案 每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。,答案,(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？,答案,答案
5、DNA的羟基(OH)末端为3端；磷酸基团的末端为5端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,PCR扩增与DNA复制的异同,解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物。DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链。引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。,拓展应用,1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是 A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链 B.DNA复制不需要引物 C.引物与DN
6、A母链通过碱基互补配对进行结合 D.PCR扩增的对象是氨基酸序列,答案,解析,解析 PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。,2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题： (1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。,答案,解析,DNA的热变性原理,(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶。该酶是从 中分离的。 解析 Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。 (3)与普通DN
7、A聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。 解析 与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。 (4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。 解析 PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。,答案,解析,水生耐热细菌Taq,耐高温,一定的缓冲溶液,温度,(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。 解析 PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱
8、氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。,答案,解析,2,作为DNA复制的起点,细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？ 答案 需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。,答案,与PCR原理有关的三个易错点 (1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。 (2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。 (3)P
9、CR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。,二、目的DNA片段的体外扩增与鉴定,基础梳理,1.DNA片段的PCR扩增 (1)准备器材：PCR仪、台式高速离心机、0.2 mL PCR微量离心管、自动取液器、模板DNA等。 (2)在0.2 mL PCR微量离心管中加入 缓冲液，_的溶液各5 L, 模板DNA, 引物1和5 L引物2, 双蒸水。 (3)煮沸 之后冰浴 ，低速离心，按照1单位/L加入 。 (4)扩增DNA片段的反应程序：将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在 的条件下预热5
10、 min，再设置反应程序为： ， ，_ ， (以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为 ， 。 (5)按照PCR仪器操作要求运行反应程序。,5 L 10倍浓缩的PCR,4种脱氧,核苷酸,1 L,5 L,29 L,5 min,2 min,TaqDNA聚合酶,94 ,94 ,30 s,55 ,30 s,72 ,1 min,72 ,1 min,2.DNA分子的测定 (1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL 中，再加入1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的 溶液)。将0.1 mL B液加入10 mL A液中，混匀。 (2)条件：取一定量扩增前和扩增后
11、的溶液分别放入等量的二苯胺试剂，混匀后观察颜色变化。用 加热上述溶液。 (3)现象：出现 现象。 3.定量分析方法：如果需要进行定量分析，可以采用 或_。前者需要使用 ，后者需要使用 等。,冰醋酸,乙醛,沸水浴,蓝色,紫外分光光度法,琼脂,糖凝胶电泳法,紫外分光光度计,电泳仪,问题探究,1.实验过程分析 (1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？ 答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 (2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？ 答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均
12、匀。,答案,(3)PCR实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？ 答案 为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换。,答案,2.结果检测 (1)实验中为什么要测定DNA的含量？ 答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。 (2)如何判断DNA扩增成功？ 答案 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。 电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 (3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常
13、结果？ 答案 样品产物少，或产生新的DNA。,答案,拓展应用,3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为 设计好PCR仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分 进行PCR反应 离心使反应液集中在离心管底部 A. B. C. D.,答案,解析,解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。,4.近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，
14、将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在酶的作用下进行的。,答案,解析,氢,解旋,解旋,解析 PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。,答案,解析,(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至55 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。,两,3,从子链的5端向3端延伸,解析 PCR分为三个基本
15、反应步骤：变性(94 )、退火(55 )、延伸(72 )，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,解析 PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等。,答案,解析,(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则靠来维持。,温度,酸碱度,P
16、CR仪,缓冲液,解析 一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。,答案,解析,(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。,1/8,问题导析,问题导析 (1)解旋是使DNA双链间的 键断裂，PCR技术是利用DNA的 原理，细胞内是在 酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有 个。,答案,返回上页,氢,热变性
17、,解旋,2,课堂小结,放入PCR仪扩增,引物,复性,当堂检测,1.PCR利用了DNA的哪种特性来控制DNA的解聚与结合 A.特异性 B.稳定性 C.热变性 D.多样性,2,3,4,5,1,答案,2.符合PCR反应条件的一项是 稳定的缓冲液环境 DNA模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 DNA解旋酶 限制酶 温控设备 A. B. C. D.,答案,解析,2,3,4,1,5,解析 PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。,解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新
18、结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。,3.下列关于PCR的描述中，正确的是 PCR是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增DNA利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列 A. B. C. D.,答案,2,3,4,1,5,解析,4.如图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物A.第一次循环 B.第二次循环 C.第三次循环 D.第四次循环,解析,2,3,4,1,答案,5,解析 在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物
19、；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。,2,3,4,1,5,5.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题： (1)DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。 解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3端，含磷酸基团的是5端。引物的5端与模板链的3端结合，然后沿着引物的3端延伸。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是
20、实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR一次循环要经历变性、退火和延伸三个阶段。,答案,解析,磷酸基团,3端,2,3,4,1,5,(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到 ，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。 (3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有 个这样的DNA片段。 (4)简述PCR技术的主要应用：_(要求至少答两项)。,2,3,4,1,5,答案,耐高温的Taq DNA聚合酶,选择培养基,变性、退火和延伸,32,遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、,基因克隆和DNA序列测定等,
