1、第1课时 微生物的分离和培养,第一章 无菌操作技术实践,学习导航 1.简述高压蒸汽灭菌锅的使用方法及注意事项。 2.掌握制备细菌培养基的方法。 3.学会利用无菌操作技术接种与培养大肠杆菌。 重难点击 1.培养基的配制方法及常见种类。 2.大肠杆菌的接种与分离培养。,一、微生物分离和培养的基本理论,二、大肠杆菌的接种与分离培养,内容索引,当堂检测,一、微生物分离和培养的基本理论,基础梳理,1.无菌操作技术 实验室常利用高温处理达到灭菌效果，包括采用 或 等方法。 (1)干热灭菌方法是将拟灭菌的物品放在 内，在160170 温度下加热12 h以达到灭菌的目的。 (2)湿热灭菌方法常采用 进行，如手
2、提式高压蒸汽灭菌锅就是实验室常用的灭菌仪器之一。高压蒸汽灭菌锅的使用包括加水、装锅、 、 、出锅等步骤。,干热灭菌,湿热灭菌,干热灭菌箱,高压蒸汽灭菌锅,加热排气,保温保压,2.配制培养基 (1)培养基概念：为人工培养微生物而制备的适合微生物 、 或积累代谢产物的 。 (2)培养基类型 天然培养基：采用动植物组织或微生物细胞以及它们的提取物或粗消化物配制而成，如牛肉膏蛋白胨培养基。 优点： 、营养丰富、配制简便； 缺点： 难以控制、实验结果的重复性较差。,生长,繁殖,营养基质,取材便利,营养成分,合成培养基：由 的分析纯等级别的高纯度化学试剂加蒸馏水配制而成，如葡萄糖铵盐培养基。 优点：化学成
3、分及其含量 、实验的可重复性好； 缺点：配制繁琐、成本较高。 (3)培养基成分：一般都含有 、 (提供碳元素的物质)、 (提供氮元素的物质)和无机盐等最基本的物质。 (4)培养基的配制原则：在配制培养基时，根据 的不同需要，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的 使之满足微生物生长的需要。,准确称量,明确,水,碳源,氮源,拟培养的微生物,pH,3.接种微生物 (1)接种的概念：在 条件下将微生物接入 的操作过程。 (2)常用的接种工具： 、 、接种环等。 (3)接种方法 用 进行穿刺接种。 用接种环进行斜面接种或在固体培养基平板上进行划线接种。 用 进行涂布平板接种等。,无菌,培
4、养基,玻璃涂布器,接种针,接种针,玻璃涂布器,问题探究,1.“无菌操作”与人们的生活休戚相关，无时无处不在。在日常生活、生产实践、自身健康防护中，有哪些“无菌操作”的例子？,答案,答案 日常生活、生产实践、自身健康防护中“无菌操作”的例子分别有：(1)被褥、鞋袜要常晒；肉制品储存时用盐腌等。 (2)家畜阉割后，要在其伤口处涂抹一些酒精或白酒；初冬杨树树干涂刷生石灰水等。 (3)打针时，注射部位要用酒精棉球擦洗，一般要在其伤口处涂抹一些碘酒。,2.实验室常利用高温处理达到灭菌效果，包括采用干热灭菌或湿热灭菌等方法。以下图高压蒸汽灭菌锅的使用为例，探究无菌技术的方法。,(1)高压蒸汽灭菌的使用原理
5、是什么？ 答案 使用原理：将待灭菌物品放在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内；把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭；再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100 以上。 (2)简述手提式高压蒸汽灭菌锅的使用步骤。 答案 加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等。,答案,(3)消毒和灭菌的原理是什么？消毒和灭菌都能杀死所有的微生物吗？是否适用于所有的生物和物品？ 答案 都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。 灭菌可杀死处理材料中的全部微生物(包括芽孢和孢子)，而消毒仅能杀死物体表面或内部的部分微生物(一般不包括芽孢和孢子)。 不是，无菌技术既要考虑效果，又要
6、考虑操作对象的承受能力。例如，活体生物材料、操作者的双手等只能消毒，而不能灭菌。 (4)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答案 还能有效避免污染环境以及操作者自身被微生物感染。,答案,3.微生物的培养离不开培养基，根据下面某微生物培养基的配方回答下列问题：,(1)该培养基的碳源、氮源分别是什么？ 答案 碳源：C6H12O6；氮源：NaNO3。 (2)依据物理性质用途划分，该培养基属于什么培养基？ 答案 依据物理性质划分，该培养基属于液体培养基；依据用途划分，则属于选择培养基。 根据培养基的原料，所培养微生物的同化作用的类型是异养型，培养的微生物可能是酵母
7、菌或霉菌。 (3)在固体培养基中加入的琼脂能为微生物提供营养吗？为什么？ 答案 不能，微生物不能分解琼脂。 (4)普通培养基能培养病毒吗？为什么？ 答案 不能，因为病毒只能进行活细胞寄生生活。,答案,(1)消毒与灭菌的区别,(2)培养基的成分及功能,拓展应用,1.高温灭菌的原理是 A.每种微生物生长的最适温度是一定的 B.微生物对于高温环境不适应 C.高温破坏了微生物细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动 D.高温降低了环境中氧的浓度,解析 高温的致死作用主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子物质发生不可逆转的变性。,答案,解析,解析 根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和
8、固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。,2.下列关于培养基的说法正确的是 A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 B.培养基只有两类：液体培养基和固体培养基 C.除水以外的无机物只能提供无机盐 D.无机氮源不可能提供能量,答案,解析,培养基的种类,二、大肠杆菌的接种与分离培养,基础梳理,1.配制牛肉膏蛋白胨培养基,_,调节pH,_,灭菌,2.斜面接种和培养大肠杆菌 斜面接种大肠杆菌的主要目的有 、 和保存纯净菌种等
9、。具体操作步骤：,菌种转移,扩大培养,_,接种环灭菌,_,划线接种,_,保存菌种,3.平板划线分离和培养大肠杆菌 在实验室中，平板常常被用来 细菌等微生物。 (1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作 配制好的培养基装瓶 倒平板操作(A.打开瓶塞B._C.倒培养基D. )。 (2)平板划线分离与培养大肠杆菌 平板划线法的含义：用带有微生物的 在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。 注意事项：接种和划线操作时需要在 附近进行。,培养、分离,灭菌,灼烧瓶口,灭菌,倒置平板,接种环,酒精灯火焰,问题探究,1.利用培养基培养微生物时，首先要把微生物接种到培养基上。以牛肉膏蛋白胨培养基的配
10、制为例，完成下列有关问题： (1)以下为细菌培养基的配制的流程，若将分装步骤与调节pH步骤颠倒过来是否可行？,答案,答案 不行。若分装后再调节pH，会使培养基中pH调节不均匀；还可能将培养基弄到试管口，易被污染。,(2)从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？ 答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。,答案,2.斜面接种和培养大肠杆菌 (1)下图接种方法分别是什么？,答案,答案 图1是穿刺接种、图2是斜面接种、图3是平板划线接种。,(2)下表是关于接种操作
11、步骤及其目的或分析说明，请完善下表。,将接种环灭菌，避免污染菌种,避免杂菌污染菌种,灼烧灭菌，防止试管口菌体污染 培养基,使接种环冷却，避免杀死菌种,防止菌种沾于管壁，防止菌种 被杀死,防止杂菌污染,培养细菌，观察接种和培养的 结果,24 h,3.平板划线分离和培养大肠杆菌 在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。思考回答下列相关问题： (1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？ 答案 接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。 划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。 接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。 划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸
12、入平板内。,答案,(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。 (3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ 答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，是为了保证菌落是由单一的细菌繁殖而成。,答案,(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答案 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污
13、染环境和感染操作者。 (5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答案 划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。 (6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？ 答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，达不到纯化的效果。,答案,拓展应用,3.关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中，不正确的是 A.配制固体培养基时一般要加适量的琼脂 B.分装到试管中的液体培养基的高度约为试管高度的1/2 C.待培养基冷却至50 左右时进行搁置斜面 D.搁
14、置斜面时，斜面长度不超过试管总长的1/2,答案,解析,解析 在配制固体培养基时，琼脂是最常用的凝固剂，A正确； 分装到试管中的液体培养基的高度约为试管长度的1/5，B错误； 待培养基冷却至50 左右时进行搁置斜面，以防培养基因温度过高而烫手，也不能过低，防止凝固后不易倒平板，C正确； 搁置斜面时，将试管口部枕在高约1 cm的木条或其他合适高度的物体上，使其自然倾斜，斜面长度不超过试管总长的1/2，D正确。,解析 接种环伸入试管内后先接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位，待接种环冷却后再接触长菌部位。,4.在接种操作的过程中，不正确的是 A.要将接种环灼烧灭菌 B.取下棉塞后要将试管口灼烧
15、灭菌 C.将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位 D.接种后还要将管口灭菌加塞,答案,解析,解析 在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种时划线操作在火焰边进行；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。,5.右图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为 12345。下列操作方法正确的是 A.操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌 B.划线操作须在火焰上进行 C.在5区域中才可以得到所需菌落 D.在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌,答案,解析,(1)平板划线法所用培养基属于什么培养基？ 答案 琼脂固体培养基。 (2)如何确认制备的培养基是否合格
16、？ 答案 将一个未接种的培养基同接种培养基一起培养，若未接种的培养基无菌落生长，说明制备的培养基合格，否则需要重新制备。 (3)如果培养基上长出的菌落相互重叠，则说明存在什么问题？ 答案 说明划线不充分，应该重新操作。 (4)在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于哪里？ 答案 接种环上的菌种直接来源于上次(第一区中)划线的末端。,答案,课堂小结,接种,培养基,pH,当堂检测,1.右图是灭菌锅及其局部剖面示意图， 其中甲、乙、丙依次指 A.安全阀、排气阀、压力表 B.排气阀、安全阀、压力表 C.安全阀、排气阀、温度表 D.排气阀、安全阀、温度表,2,3,4,5,1,解析 根据教材P8图高压
17、蒸汽灭菌锅结构示意图，可判断甲、乙、丙分别为安全阀、排气阀、压力表。,答案,解析,2.在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确的顺序为 溶化 调pH 加棉塞 包扎 分装 称量 A. B. C. D.,答案,解析,解析 上述步骤中，培养基的配制顺序为称量溶化调pH分装加棉塞包扎。,2,3,4,1,5,3.下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是 A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 B.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种 C.在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液 D.划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免
18、细菌污染环境和感染操作者,答案,解析,2,3,4,1,5,解析 平板划线操作中，接种环挑取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物，以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种。划线结束仍需灼烧接种环，是为了能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。,2,3,4,1,5,4.下列依次表示倒平板、接种的位置，以及划线法接种的路径示意图，其中错误的是,解析,2,3,4,1,答案,5,解析 倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养
19、皿的皿盖，防止空气中的杂菌污染，故A正确； 接种时，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，故B正确； 划线时要从上一次划线的末端开始进行，让菌种来源于上一次划线末端，故C正确，D错误。,2,3,4,1,5,5.下表所示为某微生物培养基的配方，请回答下列问题： (1)按照物理性质，该培养基属于_培养基。 解析 培养基中没有加入琼脂，是液体培养基。 (2)该培养基中的碳源是_。不论何种培 养基，在各成分都溶化后分装前，要进行的是 调整pH和_，倒平板时，一般需冷却至_ 左右，在_附近操作。 解析 C6H12O6为微生物提供碳源，培养基在分 装前要调整pH和灭菌，倒平板时，一般需冷却 至50 左右，在酒精灯火焰附近操作。,液体,C6H12O6,灭菌,50 ,酒精灯火焰,答案,解析,2,3,4,1,5,