1、第15课时 血红蛋白的提取和分离,专题5 DNA和蛋白质技术,学习导航 1.通过阅读教材P64“基础知识”，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。 2.分析教材P66“实验操作”，掌握蛋白质提取和分离的过程。 3.阅读教材P69“操作提示”，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。 重难点击 1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。 2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。,一、蛋白质的分离技术,当堂检测,二、实验操作和操作提示,内容索引,一、蛋白质的分离技术,基础梳理,1.蛋白质的分离依据 根据
2、蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和 、所带 的性质和多少、溶解度、 和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 2.凝胶色谱法 (1)概念：也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。,大小,电荷,吸附性质,分配色谱法,相对分子质量的大小,(2)凝胶的特点(3)常用凝胶： 或琼脂糖。 (4)分离原理 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，通过凝胶的时间 。 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶_ 移动，路程 ，移动速度 ，通过凝胶的时间 。,多孔球体,多糖类化合物,贯穿的通道,葡萄糖,较长,较慢,较长,外部,较短,较快,较短,3.缓
3、冲溶液 (1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制 对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 (2)配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_就可以制得 的缓冲液。 (3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持_与体内环境中的pH基本一致。,外界的酸和碱,使用,比例,在不同pH范围内使用,体外,溶液的pH,4.电泳 (1)概念：带电粒子在 的作用下发生 的过程。 (2)原理 带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。 迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其_ 的电极移动。 分离依据：电泳利用了待分离
4、样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生 ，从而实现样品中各种分子的分离。 (3)常用的电泳方法： 电泳和 电泳。,电场,迁移,可解离,正电或负电,所带电荷相反,带电性质的差异,大小,形状,不同的迁移速度,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,问题探究,1.凝胶色谱法 (1)结合右图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表 分析不同大小的分子洗脱后的次序。,较大,较小,垂直向下运动,较长,较快,答案 相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进 入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋 白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。,(2)结合右图，分析为什么相对分子质量较大的蛋 白质会先从色
5、谱柱中洗脱出来？,答案 不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。,(3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？,答案,答案 各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。,2.电泳 (1)从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？,答案,答案 否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质SDS复合物，SDS它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间
6、的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。,(2)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？,归纳总结,琼脂糖凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的两点区别 (1)分离原理不同 琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。 (2)用途不同 琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。,拓展应用,1.凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是 A.相对分子质量较小的蛋白质 B.相对分子
7、质量较大的蛋白质 C.凝胶颗粒 D.葡萄糖或琼脂糖分子,解析 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量大的分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。,答案,解析,2.有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是 A.它们都是分离蛋白质的重要方法 B.它们的原理相同 C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 D.以上说法都正确,解析 不同蛋白质的相对分子质量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的
8、大小分离蛋白质；电泳法中带电分子迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，所以A正确；B错误； 这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以C错误。,答案,解析,二、实验操作和操作提示,基础梳理,1.样品处理 (1)红细胞的洗涤 目的：去除 。 方法： 。 标准：直至上清液不再呈现 。 (2)血红蛋白的释放,杂蛋白,低速短时间离心,黄色,蒸馏水,10,(3)分离血红蛋白溶液,分层结果(自上而下)： 第1层：无色透明的 。 第2层：脂溶性物质的 白色薄层固体。 第3层： 的水溶液 透明液体。 第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。 结果处理：将试管中的液体用 过滤，除去 沉淀层，于分液
9、漏斗中静置片刻后，分出下层的 液体。,2 000,10,甲苯层,沉淀层,血红蛋白,红色,滤纸,脂溶性,红色透明,2.透析粗分离 (1)过程：取1 mL的 溶液装入 中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的 中(pH为7.0)，透析12 h。 (2)原理：透析袋能使 自由进出，而将 保留在袋内。 (3)目的：去除样品中 的杂质。,血红蛋白,透析袋,磷酸缓冲液,小分子,大分子,相对分子质量较小,3.凝胶色谱操作纯化 (1)凝胶色谱柱的制作 (2)凝胶色谱柱的装填：凝胶用 充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，缓慢倒入凝胶色谱柱内,蒸馏水,一次性,(3)样品的加入 (4)洗脱： 下端出
10、口，加入磷酸缓冲液，连接 ，_下端出口，进行洗脱,平齐,顶端,凝胶床,关闭,缓冲液洗脱瓶,打开,4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行 的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是 。 5.操作提示 (1)红细胞的洗涤： 、离心速度与 十分重要。洗涤次数过少，无法除去 蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。,蛋白质纯度,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,洗涤次数,离心时间,血浆,(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。 (3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会
11、搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。 (4)蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。,洗脱液,洗脱次序,分离效果,问题探究,1.实验操作过程 (1)材料的选择：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？,答案 哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂细胞器，排除了其他物质对实验结果的干扰。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,答案,答案 洗涤的目的是去除血浆蛋白；离心后的上清液不再呈现黄色，证明红细胞已洗涤干净。,(2)洗涤红
12、细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？,答案 蒸馏水可以使红细胞吸水涨破，释放细胞内的血红蛋白； 甲苯是有机溶剂，可以溶解细胞膜，有助于血红蛋白的释放。,(3)在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？,答案,(4)血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？,答案 分为4层：从上往下数，第1层为无色透明的有机溶剂(甲苯)，第2层为白色的脂类物质，第3层为红色透明的血红蛋白溶液，第4层为暗红色的红细胞破碎物沉淀。 分层的液体过滤除去脂溶性沉淀层分液得下层的血红蛋白溶液。,答案,(5)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？,答案 血红蛋
13、白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除相对分子质量较小的杂质。,2.凝胶色谱操作 (1)在制作凝胶色谱柱时，凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响？,答案 凝胶色谱柱的高度是样品随缓冲溶液流过的距离，凝胶色谱柱的高度不足会导致达不到分离效果； 凝胶色谱柱的直径大小并不影响分离效果，但直径过大会导致洗脱液体积大，样品稀释度大，使实验现象不明显。,答案,(2)试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？,答案 如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的洗脱次序，影响分离的效果。,答案,(3
14、)在装填凝胶柱时，如果有气泡存在，会对蛋白质的分离有何影响？,答案 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,归纳总结,血红蛋白的提取和分离各操作的主要目的,拓展应用,3.下列关于凝胶色谱法分离血红蛋白实验中样品的加入和洗脱的叙述中，不正确的是 A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B.用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 C.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 D.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,答案,解析,解析 加样前，应打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭
15、出口，而不应使缓冲液下降到凝胶面的下面，A项不正确。 加样时不要破坏凝胶面，B项正确。 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，C项正确。 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，再加缓冲液，D项正确。,4.右图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题： (1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能。,运输,解析 血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。,答案,解析,(2)甲装置用于 ，目的是去除样品中_的杂质，图中A是 。B是溶液。,透析(粗分离),解析 甲装置为透析装置，目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。其中
16、A是磷酸缓冲液，B是血红蛋白溶液。,答案,解析,相对,磷酸缓冲液,血红蛋白,分子质量较小,(3)用乙装置分离蛋白质的方法叫 ，是根据分离蛋白质的有效方法。,凝胶色谱法,解析 乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。,答案,解析,相对分子质量的大小,(4)乙装置中，C是 ，其作用是 。,解析 乙装置中，C溶液为磷酸缓冲液，作用是洗脱血红蛋白。,磷酸缓冲液,洗脱血红蛋白,(5)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集6管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管和试管中蛋白质含量最高，则试管中的蛋白质相对分子
17、质量比血红蛋白 (填“大”或“小”)。,红色的蛋白质接近色,解析 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。最先收集到的蛋白质是血红蛋白分子，则试管内的大量蛋白质为血红蛋白。由于试管晚于试管收集得到，因此其内收集到的蛋白质比血红蛋白分子移动速度慢，其相对分子质量比血红蛋白小。,答案,解析,谱柱底端,小,凝胶色谱法分离蛋白质中确定收集蛋白质时间的方法 (1)血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质接近色谱柱底端时，就要收集流出液。 (2)其他无色蛋白质的收集：可以在实验时加入指示剂以掌握样品的移动位置，确定最佳的收集时机。,课堂小结,慢,快,pH,
18、带电性质,凝胶色谱,当堂检测,2,3,4,1,1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质 A.路程较长，移动速度较慢 B.路程较长，移动速度较快 C.路程较短，移动速度较慢 D.路程较短，移动速度较快,答案,解析 凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,解析,2,3,4,1,2.下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的原因的是 A.分子带电性质的差异 B.分子的大小 C.分子的形状 D.分子
19、的变性温度,答案,解析 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。,解析,3.下列有关提取和分离血红蛋白的程序，叙述错误的是 A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B.通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗分离 C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D.可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度,2,3,4,1,答案,解析,2,3,4,1,解析 首先通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即
20、样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，由此可知B的叙述错误。由玻璃纸制成的透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。,4.下图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：,2,3,4,1,(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是 。,解析 生理盐水与红细胞内液为等渗溶液，故用其洗涤红细胞主要是防止红细胞吸水涨裂。,防止红细胞吸水
21、破裂,答案,解析,2,3,4,1,(2)图甲表示 过程，该操作目的是去除样品中的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液， 进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以_(写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：_。,解析 图甲表示血红蛋白粗提取过程，也为透析过程。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质；若要尽快达到理想的透析实验效果，则可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法。透析袋是一种半透膜，双缩脲试剂可以透过这种半透膜，进入袋内与血清蛋白反应，生成紫色物质。,透析(粗分离),相对分子质量较小,增加,缓冲液的量(或及时更换缓冲液),出
22、现紫色；,双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血清蛋白反应，生成紫色物质,2,3,4,1,答案,解析,(3)观察图乙，往色谱柱中加样的正确操作顺序是 (用序号表示)。在进行操作前，应该等样品，且要 (填“打开”或“关闭”)下端出口。,解析 根据教材中往色谱柱中加样的 顺序可知，正确的排序为；图中进行操作是在样品上部添加缓冲液，在添加缓冲液之前，应该等样品完全进入凝胶层之后，并要关闭下端出口。,完全进入凝胶层,关闭,2,3,4,1,答案,解析,(4)图丙表示电泳法分离蛋白质的结果，不同蛋白质得以分离是因为_。,解析 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,不同蛋,白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同,2,3,4,1,答案,解析,