1、第第 2 节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 第第 1 1 课时课时 目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建基因表达载体的构建 A 组 基础对点练 题组一 目的基因的筛选与获取 1下列关于 PCR 技术的叙述，正确的是( ) APCR 技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上 B该技术需要解旋酶和耐高温的 DNA 聚合酶 C该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的 D该技术应用体内 DNA 半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件 答案 D 解析 PCR 技术扩增的目的基因序列不一定是已知的，A 项错误；该技术是通过高温来使DN
2、A 解旋的，不需要解旋酶，B 项错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板 DNA 的两条链的末端进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C 项错误。 2PCR 又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。 你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是( ) 稳定的缓冲溶液环境 DNA 模板 引物 4 种脱氧核苷酸 耐高温的 DNA 聚合酶 解旋酶 限制性内切核酸酶 温控设备 A B C D 答案 D 解析 PCR 反应的实质是模拟体内 DNA 复制， 因此需要稳定的缓冲溶液环境， 正确； PCR反应需要 DNA 模板，正确；PCR 反应
3、需要一对引物，正确；PCR 反应需要以 4 种脱氧核苷酸为原料，正确；PCR 反应需要耐高温的 DNA 聚合酶催化延伸过程，正确；PCR反应过程中通过高温使 DNA 变性解链，不需要解旋酶，错误；PCR 反应不需要限制性内切核酸酶，错误；PCR 反应过程中需要控制的关键因素是温度，因此需要温控设备，正确。 3基因 a 在人体细胞中可表达出蛋白质 a。有生物学家从人的 DNA 中分离出基因 a，并通过转基因技术将其转入了细菌。经过培养发现，该转基因细菌产生了一种新蛋白质 X。进一步分析表明：蛋白质 X 是基因 a 仅在细菌中的表达产物。下列说法正确的是( ) A基因 a 在体外扩增需要引物，在人
4、体细胞中的复制不需要 B细菌细胞和人体细胞中作为翻译模板的 RNA 碱基序列不同 C基因 a 在体外扩增和在人体细胞中复制都是在解旋酶的作用下打开双链 D将基因 a 在体外扩增时，必须要先测出基因 a 的所有脱氧核苷酸序列 答案 B 解析 基因 a 是目的基因，在体外扩增需要引物，在人体细胞中的复制也需要，A 错误；基因 a 在人体细胞中表达产物是蛋白质 a，而在细菌细胞中的表达产物是蛋白质 X，这说明人体细胞和细菌细胞中作为翻译模板的 RNA 碱基序列不同，B 正确；基因 a 在体外扩增时，利用高温打开 DNA 的双链，C 错误；将基因 a 在体外扩增时，不需要测出基因 a 的所有脱氧核苷酸
5、序列，D 错误。 题组二 基因表达载体的构建 4下列哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A启动子 B终止密码子 C标记基因 D目的基因 答案 B 解析 基因表达载体的组成为目的基因启动子终止子标记基因等。终止子位于基因的下游，是一段有特殊序列结构的 DNA 片段，可使转录在所需要的地方停止；终止密码子是mRNA 上 3 个相邻的碱基，使翻译过程在相应的地方停止。 5在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要( ) DNA 连接酶 限制性内切核酸酶 RNA 聚合酶 具有标记基因的质粒 目的基因 四种脱氧核苷酸 A B C D 答案 A 解析 构建重组质粒时， 首先要用限制性内切核酸酶切割含有目
6、的基因的DNA片段和质粒，其次需要用 DNA 连接酶将目的基因与质粒连接；RNA 聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要 RNA 聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成 DNA 的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。 6(2019 广东汕头潮南实验学校高二月考)某目的基因两侧的 DNA 序列所含的限制性内切核酸酶的酶切位点如图所示，最好选用下列哪种质粒作为载体( ) 答案 D 解析 目的基因仅一侧含有限制酶 Nhe的识别序列，用此酶切割不能获取目的基因，A 项错误；目的基因两侧分别含有限制酶 Alu的识别序列，但只用
7、此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化， B 项错误； 目的基因两侧含有限制酶 Nhe和 Alu的识别序列，但用这两种酶切割会产生不含目的基因的片段，C 项错误；目的基因两侧分别含有限制酶 Nhe和 Sma的识别序列，用这两种酶切割会获取目的基因，而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接，D 项正确。 7下列关于基因表达载体构建的相关叙述中，不正确的是( ) A需要限制酶和 DNA 连接酶 B抗生素抗性基因可作为标记基因 C在细胞外进行 D启动子位于目的基因的上游，是启动翻译的一段 DNA 序列 答案 D 解析 启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段 DNA 序列，D 错误
8、。 8下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是( ) A切割含抗虫基因的 DNA 片段和载体必须用同一种限制酶 B抗虫基因表达载体中要有起始密码子 C抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞 D抗虫基因的表达开始于复制原点 答案 C 解析 切割含抗虫基因的 DNA 片段和载体可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A 项错误；抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子，起始密码子位于 mRNA上，B 项错误；基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中， 从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来， C 项正确； 抗虫基因的表达开始于启动
9、子，D 项错误。 9 下面是四种不同质粒的示意图， 其中 ori 为复制必需的序列， Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是( ) A基因 Ampr和 Tetr是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因 B质粒指细菌细胞中能自我复制的小型环状的 DNA 和动植物病毒的 DNA C限制酶的作用部位是 DNA 分子中特定的两个核苷酸之间的氢键 D用质粒 4 将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长 答案 D 10某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活(Amp
10、r表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr表示四环素抗性基因)。 有人将此质粒载体用 BamH酶切后，与用 BamH酶切获得的目的基因混合， 加入 DNA 连接酶进行连接反应， 用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： (1)质粒载体作为基因工程的工具， 应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子等。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基
11、因的细胞是不能区分的， 其原因是_； 并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_的固体培养基。 (3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自_。 答案 (1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞 解析 (1)作为载体必须具备如下特点：能自我复制，从而在受体细胞中稳定保存；含标记基因，
12、 以便重组 DNA 的筛选； 具一至多个限制酶切割位点， 供外源 DNA 片段插入其中。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有 Ampr的大肠杆菌才能够生长。而 Ampr位于质粒上， 故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无 Ampr， 故不能在此培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有 Ampr， 因而能在培养基中生长，目的基因的插入破坏了质粒载体的 Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成 DNA，需借助宿主细胞完成
13、DNA 复制。 B 组 综合强化练 11在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是( ) 基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子 有了启动子才能驱动基因转录出 mRNA 终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 所有表达载体中的标记基因都是抗生素抗性基因 A B C D 答案 B 解析 基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等，错误；有了启动子才能驱动基因转录出 mRNA，正确；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，正确；不同的基因表达载体中的标记基因不一定都是抗生素抗性基因，错误。 12用 PCR 技术将 DNA 分子中的 A1片段进行扩增，设计了引物、，其连接部
14、位如图所示，X 为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分 DNA 片段是图中的( ) 答案 D 解析 利用 PCR 技术将 DNA 分子中的 A1片段扩增时，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸总是从 5端到 3端。据此依题意和图示分析可知，扩增后得到的绝大部分DNA 片段如图 D 所示。 13环境雌激素(EEs)会影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在 EEs 的诱导下，会表达出卵黄蛋白原(vtg)。已知绿色荧光蛋白(GFP)基因能使斑马鱼发光，欲获得能检测水中是否含有 EEs的转基因斑马鱼，下列操作合理的是( ) A将 EEs 基因的启动子与 GFP 基因重组 B将 vtg 基因的启动
15、子与 GFP 基因重组 C将 GFP 基因的启动子与 GFP 基因重组 D将 GFP 基因的启动子与 vtg 基因重组 答案 B 解析 由题意可知， 环境中的 EEs 可诱导斑马鱼体内 vtg 基因的表达， 在不含 EEs 的环境中，斑马鱼体内 vtg 基因不能表达。因此，只要将 vtg 基因的启动子与 GFP 基因重组并导入斑马鱼体内，便能根据斑马鱼是否发光检测水中是否含 EEs。 14如图所示为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使 PCR 扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( ) 注：图中不同限制酶的识别序列及切割形成的
16、黏性末端均不相同。 ANde和 BamH BNde和 Xba CXba和 BamH DEcoR和 Kpn 答案 A 解析 构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位，故只能选用 Nde和 BamH切割质粒和含目的基因的 DNA 片段，因此在 PCR 扩增的该基因的两端需分别引入 Nde和 BamH两种限制酶的识别序列。 15为了构建重组质粒 pZHZ2，可利用限制酶 E、F 切割目的基因和质粒 pZHZ1，后用相应的酶连接。下列叙述中错误的是( ) A基因工程的核心就是构建基因表达载体 B质粒 pZHZ2 上存在 RNA 聚
17、合酶结合的位点 C重组质粒 pZHZ2 只能被限制酶 G、H 切开 D质粒 pZHZ1、pZHZ2 复制时一定会用到 DNA 聚合酶 答案 C 16(2020 山东高二期中)下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( ) A不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同 BPCR 反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关 C在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体 D质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的 DNA 上并表达 答案 C 解析 限制酶具有专一性，不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同，A 错误；PCR 反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，与扩
18、增的目的基因和引物有关，B 错误；在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高，C 正确；质粒本身也是 DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到体细胞的 DNA 并表达，D 错误。 17(2019 衡水市高二期末)研究人员利用小鼠的单倍体 ES 细胞(只有一个染色体组)，成功培育出转基因小鼠。其主要技术流程如图所示，请分析回答下列问题： 注：、代表四种限制酶，箭头指向的位置为限制酶的切割位点；Ampr是氨苄青霉素抗性基因，Neor是 G418 抗性基因。 (1)利用 PCR 技术可以扩增目的基因，PCR 反应体系中除含缓冲
19、溶液、模板 DNA、dNTP(包含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物外，还应含有_；引物应选用下图中的_(填图中的字母)。 (2)在基因工程操作步骤中， 过程称为_。 已知氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的 G418 能有效杀死不具有 Neor的小鼠细胞。结合上图推测，过程选用的 2 种限制酶是_(填图中的编号)，处的培养液应添加_(填“氨苄青霉素”或“G418”)。 (3)图中桑葚胚需通过_技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对小鼠进行_处理。 答案 (1)耐高温的DNA聚合酶 A和D (2)基因表达载体的构建 和 G418 (3)胚胎移植 同期发情 18(
20、2020 山东高二期中)肆虐全球的新型冠状病毒(COVID19)为有包膜病毒，基因组为单股正链 RNA。基于其特异性的基因组序列，科研工作者研制的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(RTPCR 荧光探针法)为新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控提供了快速、精准的检测方案。RTPCR 荧光探针法通过荧光标记的特异性探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品通过检测荧光信号的累积(以 Ct值表示)来确定样本中是否有病毒核酸，其具体操作过程如下图。请回答下列相关问题： (1)新型冠状病毒(COVID19)的相关蛋白能在宿主细胞中正常表达的理论基础是_。 (2
21、)该反应体系中，过程需要用到_酶。 (3)过程使反应体系中的模板 DNA 解链为单链的条件是_，其作用是破坏了DNA 双链分子中的_，引物 A、B 的作用是_。 (4)采集新冠肺炎疑似患者的咽部细胞样本提取核酸进行上述 RTPCR 过程，每一个扩增出来的 DNA 序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的目的基因越多，观察到的 Ct 值就越_。 答案 (1)生物的遗传物质都是核酸，具有相似的组成成分和结构；遗传信息的传递都遵循中心法则(都遵循碱基互补配对原则)，所有生物共用一套密码子 (2)逆转录 (3)加热至 90 以上 氢键 定位目的基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点 (4)大