1、第第 2 2 课时课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 将目的基因导入受体细胞 自主梳理 提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入 (1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T- DNA 上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的 T- DNA 拼接到受体细胞染色体的 DNA 上。 (2)两次导入： 第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒重新导入农杆菌； 第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T- DNA 导入受体细胞。 (1)花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，主要适用于双子叶植物和裸子植物。() 提示：
2、农杆菌转化法主要适用于双子叶植物和裸子植物。 (2)农杆菌侵入植物细胞后，其 Ti 质粒上的 TDNA 能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体 DNA 上。() (3)培育转基因动物时，常选择受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中。() (4)将目的基因导入原核细胞时， 通常用大肠杆菌作为受体细胞， 并需要用 Ca2处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的状态。() 典型例题 (2020 黑龙江哈尔滨三中高二期末)下列关于目的基因导入受体细胞的方法中， 不正确的是( ) A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B.用 Ca2处理大肠杆菌，使之
3、成为感受态细胞 C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物 解析 目前我国的转基因抗虫棉是利用花粉管通道法培育的，A 正确；为使大肠杆菌易吸收DNA 分子， 应先用氯化钙溶液进行处理， 使大肠杆菌处于易于吸收周围环境中 DNA 分子的感受态，B 正确；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最为有效的一种方法，C 正确；农杆菌转化法可将目的基因导入双子叶植物细胞，D 错误。 答案 D 变式训练 (2020 郑州一中高二期末)下列关于农杆菌转化法的叙述，错误的是( ) A.农杆菌是一种生活在土壤中的微生物，能在自然情况下侵染双子叶植物和裸
4、子植物 B.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共同培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株 C.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植物并获得种子，再进行筛选鉴定 D.由于农杆菌自然状态下对大多数单子叶植物没有侵染能力， 所以不可能利用农杆菌转化法转化玉米、水稻等单子叶植物细胞 解析 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功，D 错误。 答案 D 联想质疑 显微注射法 花粉管通道法 1.将目的基因导入植物细胞，通常有哪些方法？ 提示：花粉管通道法和农杆菌转化法。 2.将目的基因导入动物细胞时，受体细胞通常选择什么细胞？采用何种方法导入？ 提
5、示：动物受精卵，显微注射法。 目的基因的检测与鉴定 自主梳理 (1)常使用 PCR 等技术，从分子水平上检测棉花的染色体 DNA 上是否插入了 Bt 基因或 Bt 基因是否转录出 mRNA。() (2)从分子水平上检测目的基因是否翻译出相关蛋白质的方法之一是利用抗原抗体杂交技术。() (3)可以通过盐碱地栽培试验从细胞水平上检测转基因抗盐碱作物是否具有抗盐碱的特性以及抗盐碱的程度。() 提示：作物抗盐碱栽培试验属于个体生物学水平。 典型例题 (2020 大名县第一中学高二期末)目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定关键步
6、骤的是( ) A.检测受体细胞是否有目的基因 B.检测受体细胞是否有致病基因 C.检测目的基因是否转录 mRNA D.检测目的基因是否翻译蛋白质 解析 检测受体细胞中是否有目的基因是鉴定和检测的第一步， 但即便受体细胞中存在目的基因， 不能说明目的基因一定会稳定遗传并表达， A 错误； 目的基因不一定是致病基因， B 错误；检测目的基因是否转录 mRNA，但能否翻译成相应的所需蛋白质却不一定，所以该步不是最关键的步骤，C 错误；检测目的基因是否翻译蛋白质是检测目的基因是否表达的最后步骤，如果存在该蛋白质，说明目的基因能在受体细胞内稳定存在并能表达，D 正确。 答案 D 变式训练 (2020 漯
7、河四高高二期末)PCR 在生物学实验中具有非常广泛的用途，下列不属于PCR 的应用范畴的是( ) A.扩增和筛选目的基因 B.检测目的基因是否导入受体细胞 C.检测目的基因是否转录出 mRNA D.检测目的基因是否翻译出蛋白质 解析 检测目的基因是否翻译出蛋白质，常使用抗原抗体杂交的方法，D 错误。 答案 D 联想质疑 转 Bt 抗虫玉米 1.目的基因已经插入受体细胞的染色体 DNA 上，为什么还要进行转录和翻译水平的检测？ 提示：插入的目的基因不一定会表达。 2.从目的基因表达的角度上看，目的基因的检测与鉴定主要包括哪些步骤？检测的技术手段分别是什么？ 提示：检测目的基因是否转录出 mRNA
8、：PCR 等技术；检测目的基因是否翻译出特定的蛋白质：抗原抗体杂交技术。 DNA 片段的扩增及电泳鉴定 自主梳理 1.DNA 片段的扩增 2.PCR 扩增产物的电泳鉴定 (1)利用 PCR 扩增 DNA 片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用 94 的高温处理反应液5 min 进行预变性。() (2)PCR 中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。() 提示：PCR 中离心的目的是让反应组分集中分布在离心管的底部。 (3)电泳鉴定PCR产物时， 应在每个加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。() 提示：电泳鉴定 PCR 产物时，应在一个加样孔中加入分子大小的标准参照物，其
9、他加样孔中加入等量的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液的混合液。 典型例题 (2020 江苏卷，33)如果已知一小段 DNA 的序列，可采用 PCR 的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以 EcoR 酶切为例)： 请据图回答问题： (1)步骤用的 EcoR 是一种_酶，它通过识别特定的_切割特定位点。 (2)步骤用的 DNA 连接酶催化相邻核苷酸之间的 3羟基与 5磷酸间形成_；PCR循 环 中 ， 升 温 到 95 是 为 了 获 得 _ ； Taq DNA 聚 合 酶 的 作 用 是 催 化_。 (3)若如表所列为已知的 DNA 序列和设计的一些 PCR 引物，步骤选用的 P
10、CR 引物必须是_(从引物中选择，填编号)。 DNA 序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 PCR 引物 5AACTATGCGCTCATGA3 5GCAATGCGTAGCCTCT3 5AGAGGCTACGCATTGC3 5TCATGAGCGCATAGTT3 (4)对 PCR 产物测序，经分析得到了片段 F 的完整序列。下列 DNA 单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是_。 A.5AACTATGCGAGCCCTT3 B.5AATTCCATGCTGAATT3 C.5GCAATGCGTTCGGGAA3 D.5TTGATACGCCGAGTAC3 解析 (1)根据题图可知，步
11、骤是获取目的 DNA 片段，所用的酶 EcoR 是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列， 并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 (2)步骤是将目的 DNA 片段连接成环状， 其中 DNA 连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的 3羟基和 5磷酸间形成磷酸二酯键。PCR 循环中，升高温度到 95 是为了打开氢键使双链解旋，获得 DNA 单链，Taq DNA 聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物 3端，合成DNA 子链。 (3)引物的作用是使 DNA 聚合酶能够从引物的 3端开始延伸 DNA 子链， 因为 DNA的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸，故为扩增未知序列，选
12、择的与模板链相结合的引物应为 5TCATGAGCGCATAGTT3(引物)和 5GCAATGCGTAGCCTCT3(引物)。 (4)分析题意可知，片段 F 的两端为限制酶 EcoR 切割后产生的黏性末端，因此其 5端序列应为AATT，3端序列应为TTAA，B 正确。 答案 (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA 单链 以 DNA 为模板的 DNA 链的延伸 (3) (4)B 变式训练 (2020 北京四中高二期末)用 PCR 方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中 1 号为 DNA 标准样液(Marker)，10 号为蒸馏水。PCR 时加
13、入的模板DNA 如图所示。据此做出分析不合理的是( ) A.PCR 产物的分子大小在 250 至 500 bp 之间 B.3 号样品为不含目的基因的载体 DNA C.9 号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10 号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 解析 PCR过程中， 可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。 49号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合 2 号野生型和 10 号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为 250500 bp，A 正确；3 号 PCR 结果包含 250500 bp 片段，应包含目的基因，B错误；9 号 PCR 结果不包含 250500
14、 bp 片段，所以不是所需转基因植株，C 正确；10 号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10 号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D 正确。 答案 B 联想质疑 微量移液器 1.PCR 过程需要解旋吗？是通过什么手段实现的？ 提示：需要，高温。 2.加液时，都需要加入哪些组分？ 提示：扩增缓冲液、4 种脱氧核苷酸、引物、TaqDNA 聚合酶、模板 DNA、水等。 (1)为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量移液管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。 (2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
15、思维导图 晨读必背 1.转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.将目的基因导入植物细胞的常用方法除了花粉管通道法之外，还有农杆菌转化法等。 3.将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射直接将目的基因注入动物的受精卵中。 4.在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中大肠杆菌的应用最为广泛。一般先用 Ca2处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态， 然后再将重组的基因表达载体导入其中。 5.在电场的作用下，DNA 等带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程称为电泳。 随堂检测 1.下图表示用化学方法合
16、成目的基因的过程。据图分析下列叙述正确的是( ) A.过程需要 DNA 连接酶 B.过程需要限制酶 C.目的基因的碱基序列是已知的 D.若某质粒能与目的基因重组，则该质粒和的碱基序列相同 解析 过程发生碱基互补配对，不需要 DNA 连接酶，A 错误；过程发生碱基互补配对，不需要限制酶，B 错误；用人工的方法化学合成目的基因必须知道目的基因的碱基序列，C 正确； 某质粒能与目的基因重组， 只需要有相同的黏性末端即可， 不必所有序列都相同， D 错误。 答案 C 2.科学家在某种农杆菌中找到了抗枯萎病的基因， 并以 Ti 质粒作为载体， 采用转基因方法培育出了抗枯萎病的金花茶新品种。下列有关叙述正
17、确的是( ) A.质粒是最常用的载体之一，质粒的存在与否对宿主细胞的生存有决定性的作用 B.应将抗枯萎病基因导入受精卵，否则不能达到该基因在各组织细胞都表达的目的 C.抗枯萎病基因能在金花茶细胞中表达，是因为两者的 DNA 结构相同 D.通过该方法获得的抗枯萎病金花茶，将来产生的花粉中不一定含有该抗病基因 解析 一般来说，质粒对受体细胞无害，即存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用，A 错误；由于植物细胞具有全能性，则转基因植物的受体细胞可以是受精卵或体细胞，B 错误；抗枯萎病基因之所以能在金花茶细胞中表达，原因是两者共用一套遗传密码，并且基因表达方式相同，C 错误；导入受体细胞的抗枯萎病的基
18、因是单个的，而花粉是减数分裂后的产物，因此有的花粉是不带有抗病基因的，D 正确。 答案 D 3.常用 DNA 进行亲子鉴定。其原理是从被测试者的血液或口腔上皮细胞中提取 DNA，用限制性内切核酸酶将 DNA 样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动 DNA 小片段分离，再使用特别的 DNA 探针去寻找特定的目的基因。DNA 探针与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在 X 光下，便会显示由 DNA 探针凝聚在一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次该过程，每一种探针用于寻找 DNA 的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得
19、到超过 99.9%的父系分辨率。请问，DNA 探针是指( ) A.某一个完整的目的基因 B.目的基因片段的特定 DNA C.与目的基因相同的特定双链 DNA D.与目的基因互补的特定单链 DNA 解析 根据题干信息“用限制性内切核酸酶将 DNA 样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动 DNA 小片段分离，再使用特别的 DNA 探针去寻找特定的目的基因”可知，DNA 探针不是一个完整的目的基因， A 错误； DNA 探针不是目的基因片段的特定 DNA， B 错误； “每一种探针用于寻找 DNA 的不同部位形成独特的条码”，指的是根据碱基互补配对原则形成的杂交带，所以 DNA 探针是与目的基
20、因互补的特定单链 DNA，C 错误，D 正确。 答案 D 4.(2020 辽宁高二期末)如图表示利用基因工程制备抗体的基本途径，据图回答下列问题： (1)上图中的细胞是_，过程是_过程。 (2)抗体基因可以通过 PCR 技术扩增获得。首先从基因组数据库中查询需合成的抗体基因mRNA 的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成_，并以上图中的_为模板直接进行 PCR 扩增。若下图为第一轮循环产生的产物，请绘出以 a链和 b 链为模板经 PCR 扩增的产物_。(要求：在产物中标出 a、b 链和引物的种类) (3)图中将目的基因导入大肠杆菌的过程中，_(填“要”或“不需要”)利用Ca2处理大肠杆菌制备感
21、受态细胞，原因_ _。 (4)为检测目的基因在大肠杆菌中是否翻译，可从大肠杆菌中提取_，进行_杂交实验。 解析 (1)通过分析可知，图中的细胞是浆细胞，过程是逆转录过程。 (2)从基因组数据库中查询抗体基因 mRNA 的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成引物，用于 PCR 扩增。并以题图中的 cDNA 为模板直接进行 PCR 扩增。图中为第 1 轮循环产生的产物，则以 a 链和 b 链为模板经 PCR 扩增的产物如图： (3)不需要利用 Ca2处理大肠杆菌制备感受态细胞，原因是噬菌体可以侵染大肠杆菌，将重组DNA 分子注入大肠杆菌。 (4)检测目的基因在大肠杆菌中是否翻译成功，可从大肠杆菌中提取抗体，进行抗原抗体杂交实验。 答案 (1)浆细胞 逆转录 (2)引物 cDNA (3)不需要 噬菌体可以侵染大肠杆菌， 将重组 DNA 分子注入大肠杆菌 (4)抗体 抗原抗体