1、第第 2 2 节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 第第 1 1 课时课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 目的基因的筛选与获取 自主梳理 1.筛选合适的目的基因 2.利用 PCR 获取和扩增目的基因 (1)目的基因主要是编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。() (2)筛选目的基因的主要方法是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。() (3)PCR 需要耐高温的 DNA 聚合酶、解旋酶、4 种脱氧核苷酸和 DNA 模板之外，还需要引物等基本条件。() 提示：PCR 不需要解旋
2、酶的参与。 (4)PCR 的每一个循环都包括变性复性延伸三个步骤， 延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。() 典型例题 (2020 北京高二期末)实验室常用 PCR 技术对 DNA 进行体外扩增，下列相关叙述正确的是( ) A.90 以上时 DNA 的磷酸二酯键断开 B.引物与模板结合后向 5方向延伸 C.反应过程包括变性复性延伸 D.需要解旋酶和耐高温的 DNA 聚合酶 解析 90 以上时是 DNA 的氢键断开，A 错误；引物与模板结合后向 3方向延伸， B 错误； 反应过程包括变性复性延伸， C 正确； PCR 技术通过高温解旋，不需要解旋酶，D 错误。 答案 C PCR 技术与细胞内
3、 DNA 复制的比较 变式训练 (2019 福建高二期末)下图表示形成 cDNA 并进行 PCR 扩增的过程。 据图分析，下列叙述正确的是( ) A.过程所需的原料是核糖核苷酸 B.过程所需的酶必须耐高温 C.过程需要解旋酶破坏氢键 D.过程的引物对之间不能互补配对 解析 过程为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A 错误；过程由 DNA 单链合成 DNA 双链过程所需要的 DNA 聚合酶不需要耐高温，B 错误；过程为变性，温度上升到 90 以上时，双链 DNA 解聚为单链，不需要 DNA 解旋酶破坏氢键，C 错误；过程为复性，温度降到 50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条 DNA 单链结
4、合，但引物对之间不能互补配对，D 正确。 答案 D 素养提升 科学探究PCR 下图表示 PCR 的前三个循环，目的基因位于模板 DNA 分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题： (1)经过第几轮扩增后，扩增出的含有目的基因的 DNA 片段才不含黏性末端？比例是多少？ 提示：第 3 轮；1/4。 (2)PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 提示：不是，PCR 扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定 DNA 片段。 (3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用 PCR 筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 典型例题 (2019 玉溪市
5、江川区第二中学高二开学考试)PCR 技术中，如何设计引物( ) A.PCR 引物要根据需要扩增的目标 DNA 的碱基序列来设计 B.PCR 引物要根据已知的 DNA 序列对应的 RNA 序列来设计 C.PCR 引物要根据已知的 DNA 序列对应的 tRNA 的序列来设计 D.以上都不是正确方法 解析 设计引物就是直接根据基因序列来设计，即根据需要扩增的目标 DNA 的碱基序列来设计，A 正确。 答案 A 变式训练 (2019 安徽师范大学附属中学高二期中)关于PCR技术的说法不正确的是( ) A.PCR 技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B.PCR 过程中只需要两个引物
6、分子 C.PCR 的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的 DNA 聚合酶 D.PCR 过程中 DNA 合成方向是 5到 3 解析 PCR 技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A 正确；PCR 过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B 错误；PCR 的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的 DNA 聚合酶， C 正确； PCR 过程中 DNA 合成方向是 5到 3， D 正确。 答案 B 联想质疑 PCR 的一个循环过程 在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。另外，也可以采用人工合
7、成目的基因的方法。 1.细胞内 DNA 复制时是否需要引物？为什么？ 提示：需要；因为 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA 单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条 DNA 单链的 3端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA 或 DNA 作为引物。 2.PCR 过程中，如果两种引物之间互补序列较长的话，会有什么样的结果？ 提示：可能造成复性过程中，引物之间相互结合，从而使引物不能很好地与模板DNA 链结合。 3.用 PCR 可以扩增 mRNA 吗？ 提示：不能。PCR 的原理是 DNA 复制，只可用于扩增 DNA。 PCR 需要的引物数量 1 个模板 DNA 分子经过 n 轮 PCR，
8、 可以扩增出 2n个 DNA 片段， 共需要引物数量为 2n2 个。 基因表达载体的构建 自主梳理 提醒：(1)启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点；终止子是转录的终止信号，而非转录的终止位点。 (2)构建基因表达载体时，可以用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA 片段； 也可以用能产生相同末端的不同限制酶分别切割载体和含有目的基因的 DNA 片段。 (3)由于限制酶识别的核苷酸序列通常是回文序列，所以经一种和几种限制酶切割后形成的黏性末端如果是相同的，也一定是互补的。 (4)有时为了满足应用需要， 会在载体中人工构建诱导型启动子， 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
9、。 (1)一个完整的基因表达载体由目的基因、标记基因、起始密码子、终止密码子和复制原点等组成。() 提示：一个完整的基因表达载体由目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点等组成。 (2)启动子位于目的基因的上游，是转录的起始位点，是一段有特殊序列结构的DNA 片段。() 提示：启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点，启动子紧挨目的基因的转录起始位点。 (3)构建基因表达载体时，必须使用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA 片段。() 提示：构建基因表达载体时，可以用同一种限制酶或能产生相同末端的不同种限制酶切割载体和含有目的基因的 DNA 片段。 典型例题 (2020 黑龙江
10、双鸭山一中高二期末)如图是利用基因工程技术培育转基因植物， 生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中 Pst、 Sma、 EcoR、 Apa为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( ) A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 B.表达载体构建时需要用到限制酶 Sma C.图示过程是基因工程的核心步骤 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 解析 卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，A 正确；构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶 Pst、EcoR，B 错误；图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工
11、程中的核心步骤，C 正确；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D 正确。 答案 B 变式训练 (2019 天津静海一中高三月考)图甲、图乙分别表示质粒和外源 DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是( ) A.用质粒和外源 DNA 构建重组质粒过程中，不能使用 Sma 切割 B.图甲所示的质粒分子在经 Sma 酶切割后含有 4 个游离的磷酸基团 C.为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 DNA 聚合酶 D.用 EcoR 、Hind 和 Bam H中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以 解析 据图分析， 质粒中， Sma 的切割位点位于标记
12、基因(抗生素抗性基因)上，在外源 DNA 分子中， Sma 的切割位点位于目的基因上， 因此用质粒和外源 DNA构建重组质粒过程中，不能使用 Sma 切割，A 正确；图甲所示的质粒分子只有一个 Sma 切割位点，所以在经 Sma 酶切割后含有 2 个游离的磷酸基团，B 错误；为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 DNA 连接酶，C 错误；只使用 EcoR，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用 DNA连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用 BamH或 Hind 剪切时，在目的基因上只有一个酶切位点，因此不能切割目的基因，D 错误。 答案 A 素养提升 科学思维
13、批判性认识“单酶切法”和“双酶分别切割法” 构建基因表达载体时，可以采用以下两种方法(如下图)：单酶切法：用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的 DNA 片段；双酶分别切割法：用两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的 DNA 片段。 (1)已知 BamH和 BgI识别的核苷酸序列和切割位点分别为： 则 DNA 分子经 BamH和 BgI切割后所形成的末端是否互补(相同)? 提示：互补(相同)。 (2)黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？此现象说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”具有什么缺点？ 提示：均能，因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端互补(相同)。
14、说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”会导致载体和目的基因的自身环化。 (3)黏性末端 1 与 4、2 与 3 能否经 DNA 连接酶连接？此现象说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”具有什么缺点？ 提示：均能。说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”会导致载体与目的基因的反向连接。 典型例题 (2020 成都七中高二月考)在构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶去切割载体和目的基因所在的 DNA 分子。下列相关叙述错误的是( ) A.可以选择同一种限制酶分别切割载体和目的基因所在的 DNA 分子 B.可以选择能产生相同末端的两种限制酶分别切割载体和目的基因所在的 DNA分子 C.可以选择一种限制酶
15、去切割载体， 另一种限制酶(产生的黏性末端与前一种不同)去切割目的基因所在的 DNA 分子 D.构建基因表达载体时，除了要用到限制性内切核酸酶之外，还要用到 DNA 连接酶 解析 选择一种限制酶去切割载体， 另一种限制酶(产生的黏性末端与前一种不同)去切割目的基因所在的 DNA 分子，将会导致目的基因两侧的黏性末端与载体切口处的两个黏性末端不能互补，因而无法连接形成重组载体。 答案 C 变式训练 (2020 漯河四高高二期末)构建基因表达载体时，应选择用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的 DNA 分子。下列相关叙述中，正确的是( ) A.用同一种限制酶时，会导致载
16、体和目的基因的自身环化，以及目的基因与载体的任意链接 B.用能产生相同末端的限制酶时，能避免载体和目的基因的自身环化，以及目的基因与载体的任意链接 C.能产生相同末端的限制酶其识别的核苷酸序列和切割位点一定是相同的 D.能产生相同末端的限制酶其识别的核苷酸序列和切割位点一定是不同的 解析 用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶时，都会导致载体和目的基因的自身环化，以及目的基因与载体的任意连接，A 正确、B 错误；能产生相同末端的限制酶，其识别的核苷酸序列和切割位点不一定相同，如 BamH的识别序列和切割位点为GGATCC，BgI 的识别序列和切割位点为AGATCT，两者的识别序列和切割位点不同
17、，但形成的黏性末端是相同的；又如 Xbal和 Xho两种限制酶的识别序列和切割位点均为CTCGAG，C、D 错误。 答案 A 联想质疑 目的基因导入植物细胞时常选用植物的体细胞作为受体细胞，主要是因为植物体细胞具有全能性，且取材方便，而动物的体细胞不易表达全能性，故而对动物细胞来说，常选用全能性最高的受精卵为受体细胞。 一个质粒是否只能插入一种目的基因？ 提示：不是，质粒上有多个限制酶的切割位点，所以可以插入多种目的基因。 基因工程常用的质粒是在天然质粒的基础上人工改造的。 必须是相同的黏性末端才能经 DNA 连接酶进行连接，而平末端则无这种要求。 (1)“单酶切法”和“双酶分别切割法”均能成
18、功构建基因表达载体； (2)与“单酶切法”相比，“双酶分别切割法”不要求载体和目的基因两侧具有同一种限制酶的识别序列，只要两种限制酶切割后形成的黏性末端是互补(相同)的即可，具有一定程度的灵活性； (3)“单酶切法”和“双酶分别切割法”都不能避免载体和目的基因的自身环化，也都不能避免载体与目的基因的反向连接。 思维导图 晨读必背 1.培育转基因抗虫棉需要 4 个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2.苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt 抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 3.PCR 反应需要在一定的缓冲溶液
19、中才能进行，需提供 DNA 模板、分别与两条模板链结合的 2 种引物，4 种脱氧核苷酸和耐高温的 DNA 聚合酶；同时控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。每一次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 4.一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。 5.在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，然后再用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段；再利用 DNA连接酶连接形成重组 DNA 分子。 随堂检测 1.(2020 漯河四高高二期末)下列关于 PCR 的叙述，错误的是( ) A.PCR 只能扩增引物之间的 DNA 片段而非
20、整个完整的模板 DNA 分子 B.PCR 过程中变性的目的是让引物与模板 DNA 单链结合 C.PCR 的原理是 DNA 半保留复制 D.PCR 的过程需要耐高温的 DNA 聚合酶但不需要解旋酶 解析 变性的目的是通过升高温度，破坏氢键，打开模板 DNA 分子，为子链的延伸提供模板。 答案 B 2.(2020 北京四中高二期末)下图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步需用到的工具是( ) A.DNA 连接酶和解旋酶 B.DNA 聚合酶和 RNA 聚合酶 C.DNA 聚合酶和限制性内切核酸酶 D.限制性内切核酸酶和 DNA 连接酶 解析 图示表示基因表达载体的构建过程，该过程首先需要用限
21、制酶切割含有目的基因的外源 DNA 分子和质粒， 其次还需要用 DNA 连接酶将目的基因和质粒连接形成重组质粒。综上分析，D 正确。 答案 D 3.(2020 吉林高二期末)科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒 DNA 分子重组，使其在大肠杆菌体内成功表达。它们彼此能结合的依据是( ) A.基因的遗传定律 B.中心法则 C.碱基互补配对原则 D.半保留复制原则 解析 DNA 连接酶是连接两个 DNA 片段，形成磷酸二酯键。黏性末端依赖于碱基互补配对原则将碱基连接起来，并形成氢键，生成重组 DNA 分子，故选 C。 答案 C 4.(2020 平罗中学高二月考)下列有关基因表达载体
22、的叙述，不正确的是( ) A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增 B.具有启动子，使 DNA 聚合酶识别并开始转录 C.具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因 D.具有目的基因，以产生特定的基因产物 解析 基因表达载体中具有复制原点， 使目的基因能在受体细胞内扩增， A 正确；基因表达载体中具有启动子，使 RNA 聚合酶识别并开始转录，B 错误；标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，所以基因表达载体中具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，C 正确；基因表达载体中应具有目的基因，以产生特定的基因产物，D 正确。 答
23、案 B 5.(2020 山西省长治市第二中学校高二月考)下列关于基因工程的叙述，不正确的是( ) A.基因运载体的种类有质粒、噬菌体和动植物病毒等 B.EcoR这种限制酶能够专一识别 GAATTC 的核苷酸序列 C.基因工程的第二步骤是目的基因与载体结合 D.由于变异是不定向的，所以基因工程也不能定向改造生物的性状 解析 基因运载体的种类有质粒、噬菌体和动植物病毒等，A 正确；限制酶具有专一性，如 EcoR 这种限制酶能够专一识别 GAATTC 的核苷酸序列，并切割 G和 A 之间的磷酸二酯键，B 正确；基因工程的第二步骤是目的基因与载体结合，即构建基因表达载体，C 正确；基因工程能够按照人们的意愿定向改造生物的性状，D 错误。 答案 D