1、第 1 页，共 26 页 2022 届选修一生物知识清单届选修一生物知识清单 专题 1 传统发酵技术的应用 课题 1 果酒和果醋的制作 1. 果酒制作菌种是酵母菌酵母菌，是一种单细胞真菌真菌，真核真核生物，代谢类型为异养兼性厌氧型异养兼性厌氧型，适宜条件下进行 出芽出芽生殖。酵母菌在有氧条件下进行有氧有氧呼吸大量繁殖繁殖，无氧条件下进行酒精酒精发酵产生酒精酒精。 （1）有氧呼吸反应式：C C 6 6 H H 12 12 O O 6 6 6H6H 2 2 O O6O 6O 2 2 酶酶6CO 6CO 2 2 12H 12H 2 2 O O能量能量 （2）无氧呼吸反应式：C C 6 6 H H 1
2、2 12 O O 6 6 酶酶2C 2C 2 2 H H 5 5 OHOH2CO 2CO 2 2 少量能量少量能量(制酒原理：酵母菌无氧呼吸将葡酵母菌无氧呼吸将葡 萄糖转化为酒精萄糖转化为酒精) 2. 果醋制作菌种是醋酸菌醋酸菌，原核原核生物，代谢类型为异养需氧型异养需氧型，以二分裂二分裂方式增殖。原理如下： （1）当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将果汁中的糖糖分解成醋酸醋酸。 反应式：C C 6 6 H H 12 12 O O 6 6 6O 6O 2 2 酶酶2CH2CH3 3COCO O O H H 2CO 2CO 2 2 2H 2H 2 2 O O （2）当氧气充足，缺少糖源氧气充足，缺少糖
3、源时，醋酸菌将乙醇乙醇变为乙醛乙醛，再变为醋酸醋酸。 反应式： C C C C2 2 2 2 H HH H 5 5 5 5 OOOOH HH H + + + + O OO O2 2 2 2 酶酶C C C CH HH H 3 3 3 3 C C C CO OO OO OO OHHH H+ + + +H HH H 2 2 2 2 O OO O 3. 葡萄酒的自然发酵，菌种来自附着在葡萄皮上的野生型酵母菌葡萄皮上的野生型酵母菌；工业酿酒可在无菌无菌条件下人工接种酵母酵母 菌菌菌种。 4. 葡萄酒呈现深红色的原因：在发酵过程中，红葡萄皮的色素进入发酵液中，使葡萄酒呈现深红色在发酵过程中，红葡萄皮的色
4、素进入发酵液中，使葡萄酒呈现深红色。 5. 在传统酿酒过程中，一般不需要严格的灭菌过程，是因为在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长 繁殖，绝繁殖，绝大多数其他微生物无法适应而受到抑制大多数其他微生物无法适应而受到抑制。 6. 果酒制作中，酒精含量达一定程度后不变不变，CO 2 也不产生，原因可能是原料耗尽或高浓度的酒精抑制了原料耗尽或高浓度的酒精抑制了 酵母菌细胞呼吸酵母菌细胞呼吸。 7. 喝剩的果酒放置一段时间后会变酸，原因是醋酸菌在有氧条件下把酒精变为醋酸醋酸菌在有氧条件下把酒精变为醋酸。 8. 制作果醋时，变酸的酒表面常常有一层白色菌膜，这层白
5、色菌膜是醋酸菌大量繁殖醋酸菌大量繁殖形成的。 9. 果酒和果醋制作流程：挑选葡萄冲洗冲洗榨汁酒精发酵酒精发酵(果酒)醋酸发酵醋酸发酵(果醋) （1）新鲜的葡萄应先冲洗再去梗冲洗再去梗。若先去梗再冲洗，会造成汁液流失和杂菌污染汁液流失和杂菌污染。 （2）冲洗的目的是洗去浮尘洗去浮尘，但不能反复冲洗反复冲洗，以防止菌种流失菌种流失。 （3）葡萄汁装入发酵瓶，要留约 1/31/3 的空间，目的是让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，防止发酵液溢出让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，防止发酵液溢出。 （4）果酒制作温度控制在 18182525，时间为 101012d12d；果醋制作温度控制在 30303535，时间为 7
6、78 8d。 （5）果酒制作前期需氧后期不需氧前期需氧后期不需氧，果醋制作一直需氧需氧。 第 2 页，共 26 页 10. 果酒和果醋制作的发酵装置（见右图） （1）充气口：在酒精发酵时应关闭关闭；在醋酸发酵时连接充气泵泵入无菌空气无菌空气。 （2）排气口：酒精发酵时排出酵母菌产生的酵母菌产生的 CO CO 2 2 ；醋酸发酵时排出剩余的空气、剩余的空气、CO CO 2 2 。 （3）出料口：取样取样、监测。 （4）排气口连接长而弯曲的胶管目的是防止空气中微生物的污染防止空气中微生物的污染。 注：若使用带盖的瓶子制果酒果醋：在发酵过程中，每隔 12h 左右将瓶盖拧松拧松一次，以放出 COCO
7、2 2 ，此后 再将瓶盖拧紧。当发酵产生酒精酒精后，再将瓶盖打开打开，盖上一层纱布纱布，进行制果醋的发酵。 11. 酒精检测：在酸性酸性条件下，橙色的重铬酸钾橙色的重铬酸钾与酒精反应呈灰绿色灰绿色。检验步骤：先在试管中加入发酵液发酵液 2mL 再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H H2 2SOSO4 4溶液 3 滴，震荡均匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾重铬酸钾溶液 3 滴，震荡试管，观察颜色的变化。 果醋的检测：可通过嗅味和品尝嗅味和品尝进行初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵强后的 PHPH 做进一步的鉴定。 课题 2 腐乳的制作 1. 参与腐乳发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等。
8、其中起主要作用的是毛霉毛霉，丝状真菌真菌，分布广泛， 常见于土壤、水果、蔬菜、谷物土壤、水果、蔬菜、谷物上，真核真核生物，代谢类型为异养需氧型异养需氧型，进行孢子孢子生殖。 2. 腐乳制作原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将腐乳中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶将毛霉等微生物产生的蛋白酶能将腐乳中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶将 脂肪水解脂肪水解为甘油和脂肪酸为甘油和脂肪酸。豆腐变为豆腐乳过程中，有机物总量减少减少，有机物种类增加增加。 3. 腐乳制作流程：让豆腐上长出毛霉加盐加盐腌制加卤汤卤汤装瓶密封腌制。 （1）豆腐含水量为 70%70%左右为宜。含水量过高，豆腐不易成形不
9、易成形；含水量过低，不利于毛霉生长毛霉生长。 （2）豆腐上长毛霉：将豆腐块平放平放在笼屉内，将温度控制在 15151818，保持一定湿度湿度，约 4848h 后，毛霉 开始生长，3 3d 之后菌丝生长旺盛，5 5d 后豆腐块表面布满菌丝；自然条件下豆腐块上的毛霉来自空气中的空气中的 毛霉孢子毛霉孢子，现代的腐乳生产是在严格无菌无菌条件下，将优良毛霉菌种毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可避免杂菌污避免杂菌污 染，保证产品品质染，保证产品品质。 （3）加盐方法：将长满毛霉的豆腐块分层整齐分层整齐地摆放在瓶中， 逐层加盐逐层加盐，随层数加高而增加增加盐量，接近 瓶口表面的盐要铺厚一些，以有效防止杂菌污
10、染防止杂菌污染。腌制约 8 8 天左右. 盐的作用：豆腐与盐的质量比为 5:15:1。盐具有析出豆腐中水分，抑制微生物生长，调味，浸提毛霉菌丝上析出豆腐中水分，抑制微生物生长，调味，浸提毛霉菌丝上 的蛋白酶的蛋白酶的作用。盐浓度过低，不足以抑制微生物的生长不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质腐败变质；盐浓度过高，会影响 腐乳的口味腐乳的口味(苦咸)。 第 3 页，共 26 页 （4）卤汤直接关系到腐乳的色、香、味色、香、味， 卤汤由酒酒及各种香辛料各种香辛料组成。卤汤中酒的含量一般控制在 12%12% 左右，酒具有抑制微生物生长及调味微生物生长及调味的作用；香辛料具有防腐杀菌和调味防腐
11、杀菌和调味的作用。酒精含量过高，腐乳成 熟时间会延长延长；含量过低，不足以抑制微生物生长不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质豆腐腐败变质。 （5）密封腌制：创造无氧无氧环境，利用厌氧菌厌氧菌产生的酶继续厌氧厌氧发酵，促进腐乳的后熟。 4.防止杂菌污染： （1）用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。 （2）装瓶时，操作要迅速小心迅速小心。 整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰 ，防止瓶 口被污染。抑制微生物生长的物质有盐、酒、香辛料盐、酒、香辛料。 5.影响腐乳品质的条件因素：（1）含水量含水量。（2）卤汤卤汤直接关系
12、到腐乳的色、香、味。（3）盐的含量盐的含量。（4） 发酵温度温度、发酵时间时间、酒酒的种类和用量，香辛料香辛料的组成。 课题 3 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量 1. 泡菜制作的菌种是乳酸菌乳酸菌，来自蔬菜表面蔬菜表面。常见乳酸菌有乳酸链球菌乳酸链球菌和乳酸杆菌乳酸杆菌，其中乳酸杆菌乳酸杆菌常用于 生产酸奶。 2. 乳酸菌属于原核原核生物，代谢类型为异养厌氧型异养厌氧型，以二分裂二分裂方式增殖。 3. 泡菜制作原理：乳酸菌在无氧无氧条件下进行乳酸发酵乳酸发酵，将葡萄糖葡萄糖分解成乳酸乳酸。（反应式：C C 6 6 H H 12 12 O O 6 6 酶酶 2C 2C 3 3 H H 6 6 O O
13、 3 3 能量能量） 4. 含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶，是因为酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用，而抗生素能够杀死酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用，而抗生素能够杀死 或抑制乳或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。 5. 泡菜坛的选择应选用火候好火候好、无裂纹无裂纹、无砂眼无砂眼、坛沿深坛沿深、盖子吻合好盖子吻合好的泡菜坛。不合格的泡菜坛容易引 起蔬菜腐烂。检查时，可将坛口向上压入水中，看坛内有无渗水有无渗水现象。也可使用玻璃制作的泡菜坛。 选用的蔬菜要新鲜新鲜，否则蔬菜中的硝酸盐硝酸盐易被还原为亚硝酸盐亚硝酸盐。 亚硝酸盐为
14、白色粉末白色粉末，易溶于水水，在食品生产中用作食品添加剂食品添加剂。自然界中，亚硝酸盐分布广泛。据统计， 蔬菜中亚硝酸盐的平均含量约为 4 4 mg/kg,咸菜中亚硝酸盐的平均含量在 7 7 mg/kg 以上， 而豆粉中的平均 含量可达 1010 mg/kg。 膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康， 但是，当人体摄人的亚硝酸盐总量达到 0.30.50.30.5 g g 时，会引 起中毒;当摄人总量达到 3g3g 时，会引起死亡。 我国卫生标准规定，亚硝酸盐的残留量在肉制品中不得超过 3030mg/kg，酱腌菜中不超过 2020 mg/kg，而婴 儿奶粉中不得超过 2 2 mg/kg。 第 4
15、页，共 26 页 膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体内以“过客”形式随尿排出，只有在特定的条件下(如适宜的 pHpH、温度、温度 和一定的微生物微生物作用)，才会转变成致癌物亚硝胺亚硝胺。 6. 配制盐水：清水与盐的质量比为 10:110:1，盐水要煮沸冷却煮沸冷却。煮沸的目的是杀菌除氧杀菌除氧，冷却是为了保证乳酸菌为了保证乳酸菌 等微生等微生物的生命活动不受影响物的生命活动不受影响。盐有杀杀菌、渗出蔬菜中过多的水分以及调味菌、渗出蔬菜中过多的水分以及调味的作用。盐水浓度不能太高， 因为盐水浓度太高会引起乳酸菌细胞渗透失水，影响乳酸菌生长繁殖，甚至导致乳酸菌死亡盐水浓度太高会引起乳酸菌细胞渗透失水
16、，影响乳酸菌生长繁殖，甚至导致乳酸菌死亡。 7. 在冷却后的盐水中加入少量“陈菜泡液”，目的是增加乳酸菌数量，缩短泡菜制作时间增加乳酸菌数量，缩短泡菜制作时间。 8. 加入调味料后要装坛密封(坛盖边沿水槽注水)，目的是创造无氧条件，利用乳酸菌发酵创造无氧条件，利用乳酸菌发酵。 9. 泡菜中亚硝酸盐的含量与腌制时间、腌制温度和食盐用量腌制时间、腌制温度和食盐用量有关。温度过高高、食盐用量过低过低、腌制时间过 短短，易造成细菌大量繁殖细菌大量繁殖，使亚硝酸盐含量增加增加。一般在腌制 10d10d 后，亚硝酸盐的含量开始下降下降。 10. 亚硝酸盐含量的测定 （1） 方法： 比色法比色法。 （2）
17、原理： 在盐酸盐酸酸化条件下， 亚硝酸盐亚硝酸盐与对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸发生重氮化反应重氮化反应后， 与 N N- -1 1- - 萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色玫瑰红色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液标准显色液进行目测比较， 可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。 （3）步骤：配制溶液制备标准显色液标准显色液制备样品处理液样品处理液比比 色色。观察样品颜色的变化，并与标准显色液标准显色液比较，找出标准液标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量， 并按照下面的公式进行计算估算出亚硝酸盐的含量。 亚硝酸盐含量=样品中亚硝酸盐含量样品中亚硝酸盐含量(mg)(mg)
18、 /取样量取样量(40mL(40mL 滤液的质量滤液的质量,kg),kg) （3）结论分析：泡菜发酵可分为三个阶段: 发酵初期，由于硝酸盐还原菌的活动，亚硝酸盐含量有所增加有所增加。 发酵中期:由于硝酸盐还原菌受抑制;同时形成的亚硝酸盐又被分解，因而亚硝酸盐含量下降含量下降。 发酵后期，硝酸盐还原菌完全受抑制因而亚硝酸盐含量继续下降继续下降 。 11. 发酵过程中应定期测定亚硝酸盐的含量， 原因是发酵不同时期亚硝酸盐含量会发生变化， 及时测定是为发酵不同时期亚硝酸盐含量会发生变化， 及时测定是为 了把握了把握取食泡菜的最佳时机取食泡菜的最佳时机。泡菜腌制过程中，亚硝酸盐的含量先增加后减少，最后
19、稳定在较低水平先增加后减少，最后稳定在较低水平。 12. 从开始制作到泡菜质量最佳这段时间，泡菜液逐渐变酸，这段时间内泡菜坛中乳酸菌数量增加增加，杂菌数 量减少减少，原因是乳酸菌比杂菌更耐酸乳酸菌比杂菌更耐酸。 第 5 页，共 26 页 13. 各种试剂的作用： 对氨基苯磺酸：与亚硝酸盐发生重氮化反应与亚硝酸盐发生重氮化反应 盐酸：营造酸性环境营造酸性环境 N-1-萘基乙二胺盐酸盐：与重氮化反应的产物结合生成玫瑰红色染料，作为测定亚硝酸盐的指示剂与重氮化反应的产物结合生成玫瑰红色染料，作为测定亚硝酸盐的指示剂 硅胶：干燥剂，用于干燥亚硝酸盐干燥剂，用于干燥亚硝酸盐 干燥后的亚硝酸钠：制备相应浓
20、度的标准比色液制备相应浓度的标准比色液 氯化镉、氯化钡：溶于蒸馏水后作为亚硝酸盐的提取剂溶于蒸馏水后作为亚硝酸盐的提取剂 氢氧化钠：中和过多的盐酸，营造碱性环境中和过多的盐酸，营造碱性环境 氢氧化铝：作为吸附剂吸附色素，使泡菜滤液脱色，变澄清作为吸附剂吸附色素，使泡菜滤液脱色，变澄清 14.自然发酵过程的白毛和白膜总结： 喝剩啤酒放置一段时间、醋坛子的表面都会长出一层白膜，这层白膜是醋酸杆菌大量繁殖形成的醋酸杆菌大量繁殖形成的。 豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝毛霉的白色菌丝。 泡菜汤内发酵液表面有时会长一层白膜这层白膜是由于产膜酵母的繁殖而形成的由于产膜酵母的繁殖而形成的。 专题 2 微生物
21、的培养与应用 课题 1 微生物的实验室培养 1. 培养基指人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长发育繁殖的营养基质人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长发育繁殖的营养基质。培养基按物理 性质分为液体培养基液体培养基和固体培养基固体培养基，区别是固体培养基中加入了凝固剂琼脂琼脂；琼脂是一种从红藻红藻中提取的 多糖多糖。琼脂在 9898以上熔化，在 4444以下凝固，在常规培养条件下呈现固态固态。培养基按用途分为选择培养选择培养 基基和鉴别培养基鉴别培养基。微生物可在固体培养基表面形成肉眼可见的菌落菌落，固体培养基可用于微生物的分离、鉴微生物的分离、鉴 定、活菌计数和保藏菌
22、种定、活菌计数和保藏菌种。液体培养基可用于细菌的选择培养细菌的选择培养/ /扩大培养扩大培养/ /富聚培养富聚培养，目的是增加目的菌的增加目的菌的 数量数量。 2. 各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐水、碳源、氮源和无机盐。另外，培养基还需要满足微生物 生长对 pHpH、特殊营养物质以及氧气、特殊营养物质以及氧气的要求。如培养细菌(如乳酸菌)时需要在培养基中添加维生素维生素，培养霉 菌(真菌)时需将培养基的 pH 调至酸性酸性，培养细菌时需将 pH 调至中性或微碱性中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需 要提供无氧无氧的条件。牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料动物原料，含有糖糖
23、、维生素维生素和有机氮有机氮等营养物质，蛋白胨提供 的主要营养为碳源、氮源、维生素碳源、氮源、维生素。牛肉膏提供的主要营养为碳源、氮源、磷酸盐、维生素碳源、氮源、磷酸盐、维生素。 第 6 页，共 26 页 3. 无菌技术的目的是获得纯净培养物获得纯净培养物，关键是创造无菌条件，防止外来杂菌的入侵创造无菌条件，防止外来杂菌的入侵。 4. 消毒和灭菌 （1）消毒：用较为温和较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分表面或内部的部分微生物，不包括不包括芽孢和孢子。 常用方法：煮沸消毒法煮沸消毒法；牛奶用巴氏消毒法巴氏消毒法，既杀死牛奶中微生物微生物，又使牛奶中的营养成分不被破坏不被破坏；用 酒
24、精酒精擦拭双手、氯气氯气消毒水源是化学药剂消毒法化学药剂消毒法；接种室、接种箱或超净工作台用紫外线消毒法紫外线消毒法。 （2）灭菌：用强烈强烈的理化因素杀死物体内外所有内外所有的微生物，包括包括芽孢和孢子。 常用方法： 灼烧灼烧灭菌：在火焰的充分燃烧充分燃烧层灼烧，可迅速彻底迅速彻底的灭菌，如接接种环、接种针、试管口、瓶口种环、接种针、试管口、瓶口。 干热干热灭菌：工具为干热灭菌箱干热灭菌箱，160160170170 下加热 1 12h2h，适用范围：能耐高温耐高温、需要保持干燥干燥的物品， 如培养皿、试管、吸管培养皿、试管、吸管等。 高压蒸汽高压蒸汽灭菌：工具为高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅，
25、100100kPa、121121下维持 15153030min（锅内盛适量水并煮沸）， 主要用于能耐高温的物品于能耐高温的物品，如培养基、无菌水、移液管培养基、无菌水、移液管。此法能留住培养基的水分能留住培养基的水分。 （4）无菌技术操作（消毒和灭菌）主要包括以下几个方面： 对实验操作的空间空间、操作者的衣着和手衣着和手，进行清洁和消毒(disinfection)。 .将用于微生物培养的器皿器皿、接种用具接种用具和培养基培养基等进行灭菌(sterilization)。 为避免周围环境中微生物的污染避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰酒精灯火焰附近进行(因为酒精灯火焰附近存在着无菌
26、区酒精灯火焰附近存在着无菌区 域域)。 实验操作时应避免已经灭菌灭菌处理的材料用具与周围的物品周围的物品相接触。 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感有效避免操作者自身被微生物感 染染。 5. 制备培养基的步骤：计算称量溶化溶化(调节调节 pHpH)灭菌灭菌倒平板倒平板。 （1）计算 注意:据配方计算配制一定体积培养基时各成各成分的用量分的用量。 （2）称量 注意:牛肉膏较粘稠粘稠，应用玻棒挑取，在称量纸称量纸上称量。牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速迅速。 称后要及时盖上瓶盖及时盖上瓶盖。 （3）溶化 将称好的牛肉膏连同称量纸称量纸一同放入烧
27、杯，加入少量水少量水，加热。 当牛肉膏溶化并与称量纸分离 后，用玻璃棒取出称量纸玻璃棒取出称量纸。加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌玻璃棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使 其熔化。 当琼脂完全融化后，补加蒸馏水至 100mL。溶化后调 PHPH，分装封口后灭菌灭菌。注意:溶化琼脂时 要不断搅拌不断搅拌， 防止琼脂糊底而导致烧杯破裂琼脂糊底而导致烧杯破裂;加热过程中部分水分蒸发， 待琼脂完全溶化后应补加蒸馏蒸馏水水， 以保持溶液的浓度。溶化时将牛肉膏连同称量纸一起加热的目的可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶 于水中于水中, ,减少误差减少误差。 第 7 页
28、，共 26 页 （4）(调 pH) 注意:由于不同微生物适宜的 pH 不同，因此在熔化后，必须用 NaOHNaOH 或或 HCIHCI 来调节 pH。在溶溶 化后灭菌化后灭菌前调节 pH，若先灭菌后调 pH 易污染培养基污染培养基。 （5）灭菌 将 50ml 培养基用玻棒转移至锥形瓶锥形瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸牛皮纸，并用皮筋勒紧皮筋勒紧，再放入高高 压蒸气灭菌锅压蒸气灭菌锅，在压力为 100100kPa、温度为 121121，灭菌 15153030min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭干热灭 菌箱菌箱内，在 160160170170下灭菌 2 2h。在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有
29、培养基的锥形瓶的目的是灭菌时灭菌时 能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用。 注意:用高压蒸汽高压蒸汽灭菌法; 培养基先调调 pHpH 再灭菌灭菌;一般是培养基先灭菌再倒平板倒平板。 （6）倒平板 注意:待培养基冷却到 5050左右时,瓶口要通过酒精灯火焰酒精灯火焰灭菌;培养基灭菌后，需要冷却到 50左右时，才能用来倒平板目的是温度过高，太烫，不易操作；温度过低，培养基易凝固温度过高，太烫，不易操作；温度过低，培养基易凝固。 平板冷凝后要将平板倒置倒置，既可防止皿盖上凝结的水滴
30、滴人培养基造成污染可防止皿盖上凝结的水滴滴人培养基造成污染; ;又可避免培又可避免培养基表面的水分养基表面的水分 过快挥发过快挥发。 6. 微生物接种方法(分离纯化细菌方法) 接种微生物的方法很多。最常用的是平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板法稀释涂布平板法。微生物的接种技术还包括斜面接种斜面接种、 穿刺接种穿刺接种等方法。虽然这些技术的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物要防止杂菌的污染，保证培养物 的纯度的纯度。 （1）平板划线法平板划线法：通过接种环接种环(工具)在琼脂固体琼脂固体培养基表面连续划线连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散逐步稀释分散 到培养基
31、表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落菌落。 灼烧接种环目的： 第一次灼烧：避免接种环上可能存在的微生物污染培养物避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 以后每次划线前灼烧：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌 种来自上次划线末端种来自上次划线末端； 划线结束灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 灼烧次数划线次数1 1。 在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高杀死菌种接种环温度太高杀死
32、菌种。 每次从上一次划线的末端开始，目的是将聚集的菌体逐步稀释分散到培养基表面，以便得到单个菌落将聚集的菌体逐步稀释分散到培养基表面，以便得到单个菌落。 用平板划线法接种划线某个平板培养后，第一区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的 第一条线上无菌落，其他环线有菌落。造成划线无菌落的原因：a.接种环未冷却接种环未冷却。b.划线未从第一区域末端划线未从第一区域末端 开始划线（第二区域的第一条线未接到第一区域末端）。开始划线（第二区域的第一条线未接到第一区域末端）。 （2）稀释涂布平板法稀释涂布平板法：用移液管移液管(工具)和无菌水无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释梯度稀释，然后用涂布器
33、涂布器(工具)将不不 同稀释度同稀释度的菌液分别均匀均匀地涂布到琼脂固体培养基琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高稀释度足够高的菌液里，聚集在一 第 8 页，共 26 页 起的微生物被分散成单个细胞单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落单个的菌落。在涂布平板时，滴加到培养基表面 的菌悬液量不宜过多（0.1ml）的原因是培养基表面的菌菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果培养基表面的菌菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。 梯度稀释原因：培养液中菌体浓度高，直接培养很难分离得到单菌落培养液中菌体浓度高，直接培养很难分离得到单菌落；目的：将聚集的菌体分散开，以将聚集的菌体
34、分散开，以 便获得单菌落便获得单菌落。 梯度稀释中，每次取样前需用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀使微生物和无菌水混合均匀。 涂布器浸在酒精中的主要目的是为涂布器的灼烧灭菌做准备为涂布器的灼烧灭菌做准备；为保证菌液均匀分布，应在涂布时转动培转动培 养皿养皿。 注：以上操作均在酒精灯火焰酒精灯火焰旁进行，防止杂菌污染杂菌污染。若要分离并统计活菌数，应选用稀释涂布平板稀释涂布平板 法法。平板划线法不能用于活菌计数的原因是菌落连成片，无法计数菌落连成片，无法计数。 7. 菌种保藏：频繁使用的菌种用临时保藏法，将菌种接临时保藏法，将菌种接种到试管的固体斜面培养基上在合适的
35、温度下培养种到试管的固体斜面培养基上在合适的温度下培养 当菌落长成后将试管放入当菌落长成后将试管放入 4 4的冰箱中保藏，的冰箱中保藏，(4 4冷藏室)，但保存时间不长，因为菌种易被污染或产生变菌种易被污染或产生变 异异；需长期保存的菌种用甘油管藏法甘油管藏法(- -2020冷冻箱中保存)。 课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1. 在自然界寻找目的菌：要根据目的菌对生存环境生存环境的要求，到相应的环境相应的环境中去寻找。实验室目的菌株筛选 原理：人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件(包括营养、温度、营养、温度、pHpH 等)，同时抑制或阻止抑制或阻止其他微生物的生长。 2. 选择
36、培养基：允许特定种类特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 例如：以尿素尿素为唯一氮源的培养基可筛选出尿素分解菌；以纤维素纤维素为唯一碳源的培养基可筛选出纤维素分 解菌；以石油石油为唯一碳源的培养基可筛选出石油分解菌；缺乏有机碳源的培养基可筛选出自养微生物自养微生物；缺 乏氮源的培养基可筛选出固氮微生物固氮微生物；加入抗生素的培养基可筛选出酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌等真菌。 3. 微生物计数方法：稀释涂布平板法（活菌计数法），显微镜直接计数法，滤膜法。稀释涂布平板法（活菌计数法），显微镜直接计数法，滤膜法。 （1）稀释涂布平板法（活菌计数法） 原理：当样品的稀
37、释度足够高稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌一个活菌。通过 统计平板上的菌落数菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 原则：设置重复组重复组，同一稀释度下至少涂布 3 3 个平板，增强实验说服力和准确性；重复组结果应一致。 为了保证结果准确，一般选择菌落数在 3030300300 的平板进行计数。 计算公式：每克样品中的菌株数(C(CV)V)MM( (个/mL)。其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌 落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液体积(mL)(一般为 0.1mL)，M 代表稀释倍数。 结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低低，原因是当两个
38、或多个细胞连在一起时，平板上观察到的当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的 只是一个菌落只是一个菌落。 第 9 页，共 26 页 需要设置未接种未接种( (或接种等量无菌水或接种等量无菌水) )的培养基的培养基作为空白对照，目的是判断培养基是否被杂菌污染判断培养基是否被杂菌污染。 需要设置牛肉膏蛋白胨培养基与选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基与选择培养基作为对照，目的判断选择培养基的筛选作用 （2）显微镜直接计数法 主要用具：血细胞计数板血细胞计数板和显微镜显微镜。 血细胞计数板使用方法： “先盖后滴再吸先盖后滴再吸”，即先盖盖玻片，后滴培养液， 再用吸水纸吸。 计算公式：1mL 培养液中细胞个
39、数小方格中细胞平均数小方格中细胞平均数40040010 10 4 4 稀释倍数稀释倍数(个/mL) 结果：估算值比实际值偏大偏大，因为该方法不能区分细胞的死活，计数到不能区分细胞的死活，计数到 的细胞数包括了死亡的细胞数的细胞数包括了死亡的细胞数。 （3）以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝伊红美蓝培养基上培养。 在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色黑色，带金属光泽。可以根据培养基上黑色菌落黑色菌落的数目，计算出水样 中大肠杆菌的数量。 4. 实验流程：土壤取样样品稀释样品稀释涂布培养与观察涂布培养与观察计数。 （1）土壤取样：土壤土壤有“微生物的天然培养
40、基”之称。土壤取样时应选取取富含有机质有机质、pH 接近中性且中性且 潮湿潮湿的距地表约 3 38 8cm 的土壤层。取一定量土溶于无菌水无菌水中，制成土壤溶液。 （2）将样品进行梯度稀释梯度稀释：样品稀释度样品稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。用一定稀释范围的样品液进行涂 布培养，以保证获得菌落数在 30300 之间、适于计数的平板。测定细菌数量一般选用 10 10 4 4 、1010 5 5 和和 10 10 6 6 倍稀释液， 测定放线菌数量一般选用 10 10 3 3 、 1010 4 4 和和 1010 5 5 倍稀释液， 测定真菌数量一般选用 10 10 2 2 、 1010 3
41、 3 和和 10 10 4 4 倍稀释液进行平板培养。 （3）培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和时间温度和时间，细菌：30303737培养 1 12 2d 放线菌：25252828培养 5 57 7d，霉菌：25252828的温度下培养 3 34 4d。 将样品涂布涂布到固体培养基表面，不能用平平板划线法板划线法。为防止皿盖上的水珠滴入培养基造成污染防止皿盖上的水珠滴入培养基造成污染，需将培养 皿呈倒置倒置状态放置。每隔 24h 统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防 止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目培养时间不足而导致遗漏菌落的数
42、目。一般来说，在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌菌 落特征落特征，这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色形状、大小、隆起程度和颜色等方面。 （4）计数：当菌落数目稳定菌落数目稳定时，取同一稀释度稀释度下至少 3 3 个平板进行计数，求出平均值平均值，并根据所对应的 稀释度稀释度计算出样品中细菌的数目。用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底皿底。 5. 未接种或接种等量无菌水的培养基未接种或接种等量无菌水的培养基( (空白对照空白对照) )上有菌落生长，说明培养基被杂菌污染。 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落的数目和种类数目和种类远大于选择培养基时，说明选择培养基具有筛选筛选作用。
43、第 10 页，共 26 页 6. 在以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源的培养基中，只有能分解尿素的细菌才能利用尿素这种氮源来生长繁殖，并长出菌 落。尿素分解菌产生的脲酶脲酶能将尿素分解成 COCO2 2和和 NHNH3 3，NH3溶于水会电离出 NH4+和 OH-，使培养基的碱性碱性 增强，pH 升高升高。在以尿素尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红酚红指示剂(鉴别培养基)培养细菌，如果菌落周菌落周 围变红（指示剂将变红）围变红（指示剂将变红），可初步确定该种细菌能够分解尿素。 7. 伊红美蓝培养基属于鉴别鉴别培养基，大肠杆菌代谢产物会和伊红美蓝发生反应，使菌落呈现黑黑色。 8.思考 1、1g
44、土的体积约为_1_1_ml ，10g 土加入到 90ml 无菌水， 相当于稀释了 1010 倍。 思考 2、 假如 104 稀释度下涂布的 3 个 平板的菌落数分别为 42、40 和 38，则 1ml 稀释液中的菌株数为 400400， 104稀释度的试管中的菌株数为 4 410103 3， 102稀释度的试管中的菌株数为 4 410105 5， 101稀释度的锥形瓶中的菌株数为 4 4 10107 7。 101稀释度的锥形瓶中的菌株来自于 10g 土，所以 1g 土中的菌株数为 4 410106 6。 样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图 101 102103104105106 1mL1m
45、L1mL1mL 9mL无菌水 90mL 无菌水 10g土样 3838 4040 4242 第 11 页，共 26 页 课题 3 分解纤维素的微生物的分离 1. 纤维素是一种多糖多糖（化学本质），其组成单位是为葡萄糖葡萄糖。纤维素酶是一种复合酶复合酶，它至少包括三种组 分，即 C C 1 1 酶酶、C C X X 酶酶和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶。纤维素 C 1 酶、C X酶纤维二糖纤维二糖 葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖。 2. 纤维素分解菌的筛选方法是刚果红染色法刚果红染色法。刚果红(简称 CR)是一种染料，能与纤维素形成红色复合物红色复合物， 当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌纤维素分解菌为
46、中心的透明圈透明圈，透明圈透明圈的大小可反应细菌降解纤维细菌降解纤维 素的能力素的能力。 3. 实验流程：土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透透 明圈明圈的菌落。 （1）土壤取样：选择纤维素含量丰富纤维素含量丰富的土壤环境采集土样。取一定量土溶于无菌水无菌水中，制成土壤溶液。 （2）选择培养(扩大培养/富聚培养)：将称取的 20 克土样，在无菌条件下加入装有 30 mL 选择培养基的 锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床摇床上，在一定温度下振荡振荡培养 1-2d, 培养液变混浊,可重复选择。选择培养用 以纤维素纤维素为唯一碳源（在选择
47、培养基中：纤维素纤维素是纤维素分解菌的唯一碳源，其它微生物的碳源为少量的 酵母膏，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖，只不过由于酵母膏的含量极少因此只有以纤维素为以纤维素为 碳源碳源的微生物才能大量繁殖。中、后期为唯一碳源）的培养基，属液体培养基液体培养基(物理性质)、选择培养基选择培养基(用 途)。选择培养的目的是增加目的菌浓度增加目的菌浓度；振荡培养的目的是增加培养液中溶解氧含量，提高营养物质的利增加培养液中溶解氧含量，提高营养物质的利 用率用率。 （3）梯度稀释：目的是使纤维素分解菌分散开，以便能够得到单细胞菌落使纤维素分解菌分散开，以便能够得到单细胞菌落。 （4）涂布培养：用固体培
48、养基固体培养基(物理性质)、鉴别培养基鉴别培养基(用途)，在此加入土豆汁的目的是利于纤维素分解利于纤维素分解 菌更好的繁殖以便形成菌落菌更好的繁殖以便形成菌落。为防止皿皿盖上的水珠滴入培养基造盖上的水珠滴入培养基造成污染成污染，需将培养皿呈倒置倒置状态放置。此 步也可用平板划线平板划线法。 （5）筛选菌株：刚果红染色法，挑选产生透明圈透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。透明圈越大，说明 细菌分解利用纤维素的能力越强细菌分解利用纤维素的能力越强(如图) 。常用的刚果红染色法包括两种，一种是先培养微生物培养微生物，再加入刚刚 果红果红进行颜色反应颜色反应，另一种是在倒平板倒平板时就加入刚果红。
49、 方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为 1 1mg/mL 的 CR（刚果红）溶液，1010- -1515min 后，倒去 CR （刚果红）溶液，加入物质的量浓度为 1mol/L 的 NaCLNaCL 溶液，15min 后倒掉 NaCLNaCL 溶液，此时，产生纤维 素酶的菌落周围将会出现透明圈出现透明圈。 方法二：配制质量浓度为 1010mg/mL 的 CR（刚果红）溶液，灭菌灭菌后，按照每 200200mL 培养基加入 1 1mL 的比 例加入 CR（刚果红）溶液，混匀后倒平板倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明出现明 显的透明圈显的透明圈。 第 12 页，共 26 页 第一种染色方法需要用到 NaCL 溶液，其作用是洗去浮色洗