1、第第 2 课时课时 目的基因的导入和检测目的基因的导入和检测 目标导读 1.结合教材 P7781图文，阐明目的基因的导入的四种方法。2.分析教材 P8183内 容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。 重难点击 1.目的基因的导入方法。2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。 方式一 通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。 在目的基因与载体连接成重组 DNA 分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进 行扩增和筛选，获得大量的重组 DNA 分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 方式二 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表
2、达其遗传特性，只有通过检测与 鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正 能够摄入重组 DNA 分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是 否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素 抗性基因，当这种质粒与外源 DNA 组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可 以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组 DNA 分子 进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 一、目的基因的导入 1.花粉管通道法(如图) (1)概念：是指外源基
3、因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然 的种胚系统形成含有目的基因的种胚。常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。 (2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序 原理：授粉后使外源 DNA 能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具 备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。 操作过程 a.提取含目的基因的总 DNA 或者质粒 DNA，配成质量分数为 0.01%的溶液。 b.用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。 c.第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。 d.0.51 h 后用一定浓度的 DNA 溶液涂抹柱头。
4、 e.收获种子，种植，进行抗虫性检测。 (3)特点 优点：简单、经济、快捷实用，且不受植物基因型的限制，理论上适用于任何开花植物。 缺点：工作效率较低，且后代的遗传情况较复杂。 2.氯化钙法 (1)适用条件：运载体是质粒，受体细胞是大肠杆菌。 (2)作用原理：氯化钙使大肠杆菌细胞成为感受态细胞，细胞膜的通透性发生变化，允许含有 目的基因的运载体分子进入。 (3)过程 (4)结果：短时间内获得大量的目的基因及目的基因的表达产物。 3.农杆菌介导的遗传转化法 (1)农杆菌：是一种土壤细菌，侵染植物细胞后，会使植物组织形成肿瘤，受感染的细胞可产 生正常细胞不能产生的生物碱，是农杆菌生长所必需的碳源和
5、氮源。 (2)原理：农杆菌的 Ti 质粒上的 T- DNA 可以转移到受体细胞，插入植物基因组，引起植物细 胞的变化。 (3)过程：目的基因插入到 Ti 质粒的 T- DNA 上 进入 农杆菌导入植物细胞稳定维持和表 达。 (4)应用：在植物转基因技术中占据主导地位，特别是在双子叶植物上尤为普遍。 (5)优点：转化频率高、成本低、操作简单，而且转基因后代的遗传组成比较容易分析。 4.基因枪法 将连接到载体上的目的基因的 DNA 溶液与金粉或钨粉共同保温， 使 DNA 吸附于金属颗粒表 面，然后，在一个真空的小室中，利用高压放电将带有基因的金属颗粒轰击进入受体，实现 转基因的目的。 知识拓展 当
6、受体细胞是动物细胞时， 经常采用显微注射技术： 目的基因表达载体提纯取 卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的转基因动物。 下图是农杆菌转化法的示意图，请分析： 1.在用土壤农杆菌介导的遗传转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么要将目的基 因插入到 Ti 质粒的 T- DNA 上？ 答案 农杆菌中的 Ti 质粒上的 T- DNA(可转移的 DNA)可转移至受体细胞，并且能插入到植 物的基因组中。 2.将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞才更有利于导入？ 答案 基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用氯化钙处理农杆菌细胞，使其处于 感受态，更有利于重组质粒的导
7、入。 3.植物基因工程常用的受体细胞可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵，为什么？ 答案 植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可 以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此，动物基因工程中的受体细胞一般只 用受精卵。 1.下列有关目的基因导入的叙述中，不正确的是( ) A.我国科学家培育抗虫棉时目的基因的导入使用的是花粉管通道法 B.基因枪法和花粉管通道法的共同特征是都可以导入单纯的目的基因 C.当运载体是质粒，大肠杆菌是受体细胞时可以利用氯化钙法导入目的基因 D.农杆菌能够将目的基因导入受体细胞的结构是 T- DNA 答案 B 解析 基因枪法是
8、将连接到载体上的目的基因的 DNA 溶液吸附于金属颗粒表面后，送入受 体细胞中的，不是单纯的目的基因。 2.下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( ) A.基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效 B.显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C.大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变 D.农杆菌介导的遗传转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 答案 A 解析 受体细胞不同，导入目的基因的方法也不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物 细胞常用的方法是农杆菌介导的遗传转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细 胞常用的方法是显微注射技术；目的基因导入大肠杆菌
9、细胞最常用的转化方法就是用氯化钙 处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。 二、目的基因的检测与表达产物的测定 1.形态检测 (1)检测目的基因的表型性状：直接根据目标性状的有无判断目的基因是否表达。 (2)检测报告基因的表型性状： 在构建表达载体时， 把一个报告基因(抗生素抗性基因或荧光标 记基因)与目的基因连在一起，通过检测报告基因的表达情况，来间接检测目的基因的表达。 2.分子检测 (1)检测目的基因是否整合到受体生物基因组中 PCR 检测：根据目的基因的序列设计引物，常用 PCR 技术对基因进行扩增，如果能扩增 出目的基因片段，说明目的基因已整合到受体细胞中。 分子杂交检测：把目
10、的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物素荧光标记，用标记好 的基因片段作探针，与受体生物的基因组 DNA 进行杂交，如果有杂交斑点，说明目的基因 已经被导入受体细胞。 (2)检测目的基因是否转录和翻译：提取目的基因的 mRNA，检测目的基因的转录情况，分离 目的基因编码的蛋白质，检测目的基因的表达情况。 下图是用基因探针检测目的基因的示意图，据图分析： 1.图中的基因探针的本质是什么？ 答案 用放射性同位素或生物素荧光标记好的目的基因的单链片段。 2.DNA 分子杂交的原理是什么？除了用于目的基因的检测与鉴定以外，试举例说明还有哪些 应用？ 答案 碱基互补配对原则。还可用于亲子鉴定、刑事侦察
11、、生物亲缘关系确定等。 3.可不可以用这种探针检测目的基因是否转录？如何检测？ 答案 可以。从转基因生物中提取的是 mRNA，用标记的目的基因作探针，与 mRNA 杂交， 如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了 mRNA。 4.检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？ 答案 用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。 3.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才 能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( ) 检测受体细胞是否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的基因是否转 录出 mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 A. B. C.
12、 D. 答案 C 解析 目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因，方法 是用 DNA 探针与基因组 DNA 杂交，还可用 PCR 检测。检测目的基因是否转录出了 mRNA， 方法是 DNAmRNA 杂交。最后检测目的基因是否翻译出了蛋白质，方法是进行抗原抗 体杂交。 4.下表有关基因表达的选项中，不可能的是( ) 选项 基因 表达的细胞 表达产物 A 细菌抗虫蛋白基因 抗虫棉叶肉细胞 细菌抗虫蛋白 B 人酪氨酸酶基因 正常人皮肤细胞 人酪氨酸酶 C 动物胰岛素基因 大肠杆菌工程菌细胞 动物胰岛素 D 兔血红蛋白基因 兔成熟红细胞 兔血红蛋白 答案 D 解析 兔成
13、熟红细胞中无细胞核和核糖体，所以兔血红蛋白基因在兔成熟红细胞中不能表达 产生兔血红蛋白。 目的基因的导入 植物 花粉管通道法 农杆菌介导的遗传转化法 基因枪法 动物：显微注射技术 微生物：氯化钙法 目的基因的检测与表达 形态检测 分子检测 PCR检测 分子杂交检测 1.在基因诊断技术中，所用的探针 DNA 分子中必须存在一定量的荧光分子或放射性同位素， 后者的作用是( ) A.为形成杂交 DNA 分子提供能量 B.引起探针 DNA 产生不定向的基因突变 C.作为探针 DNA 的示踪元素 D.增加探针 DNA 的相对分子质量 答案 C 解析 DNA 探针是指用放射性同位素或荧光分子等标记的 DN
14、A 分子，放射性同位素的作用 是作为探针 DNA 的示踪元素，C 项正确。 2.下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是( ) A.常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少 B.受体细胞所处的一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态称为感受态 C.感受态细胞吸收 DNA 分子需要适宜的温度和酸碱度 D.感受态细胞吸收重组表达载体 DNA 分子的液体只要调节为适宜的 pH 即可， 没必要用缓冲 液 答案 D 解析 将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件(如适宜的温度、pH 等)下，将基因 表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过
15、程中，可能会影响 pH 的变化，因此要 加入缓冲液，以保持适宜的 pH。 3.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因 完成了在受体细胞中的表达的是( ) A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其 mRNA C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素 DNA 序列 D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 答案 D 解析 基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能 证明目的基因在受体细胞中完成了表达。A、C 项只能说明完成了目的基因的导入，B 项只 能说明完成了目的基因的导入和转录。 4.检测转基因生
16、物是否转录出 mRNA，应通过哪种分子杂交方法实现( ) A.DNADNA 杂交 B.DNARNA 杂交 C.RNA蛋白质杂交 D.抗原抗体杂交 答案 B 解析 A、B、D 三项分别是在复制、转录和翻译水平上检测基因工程是否成功，C 项所述分 子杂交方法是不存在的。 5.萤火虫能发光是因为萤火虫体内通过荧光素酶催化的系列反应所产生的现象。如果荧光素 酶存在于植物体内，也能使植物体发光，一直以来荧光素酶的唯一来源是从萤火虫腹部提取 的。但加利福尼亚大学的一组科学家成功地通过基因工程实现了将荧光素酶基因导入到大肠 杆菌体内，并在大肠杆菌体内生产荧光素酶。请你根据已知的知识回答下列有关问题： (1)
17、获取目的基因通常有两种途径，分别为_ _。 (2)在该过程中需要多种酶的参与，其中包括_等。 (3)下列可作为受体细胞的生物有( ) A.土壤农杆菌 B.结核杆菌 C.噬菌体 D.病毒 (4)在此转基因工程中，是由质粒承担运载体的。在将体外重组的 DNA 插入大肠杆菌体内之 前通常要用_处理大肠杆菌，目的是_ _。 (5)由于荧光素酶的特殊作用，人们一直设想将其基因作为实验工具，将它和某一基因连接在 一起导入植物体内，如与固氮基因连接在一起导入植物体内，判断固氮基因是否导入的方法 是_。 (6)与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是_和 _。 答案 (1)化学合成法和从基因组中直接分离法 (2)限制性内切酶、DNA 连接酶 (3)A (4)氯化钙 增大细胞膜的通透性，使重组质粒能够导入到受体细胞内 (5)检测植物是否发光 (6)目的明确 培育周期短 可以克服远缘杂交不亲和的障碍(只要合理，两点即可)