1、第第 2 节节 基因工程的操作程序基因工程的操作程序 第第 1 课时课时 目的基因的获得目的基因的获得、基因表达载体的构建基因表达载体的构建 目标导读 1.阅读教材 P7274图文，掌握获取目的基因的两种方法。2.结合教材 P77图 4 11，理解基因表达载体的构建过程。 重难点击 1.目的基因的含义及常用获取方法。2.基因表达载体的构建。3.大肠杆菌质粒 DNA 的提取。 抑制疾病传播的转基因蚊子 巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、 丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育 出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学
2、家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因 的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减 少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们 一起来学习基因工程的基本操作程序吧！ 一、目的基因的获得 1.目的基因：是指人们所需要的进行研究的基因，如抗虫基因、抗病基因等。 2.获取目的基因的方法 (1)化学合成法 概念：利用化学反应直接合成基因。 适用条件：已知核苷酸序列的、相对分子质量较小的目的基因。 仪器：DNA 自动合成仪。 缺点：成本昂贵，不适用于序列未知的目的基因。 (2)从基因组中直接分离法鸟枪法(如图所示) (
3、3)PCR 扩增： 在掌握了目的基因的部分或全部信息后， 可以设计引物， 利用 DNA 扩增仪(PCR 仪)直接扩增目的基因。 (4)反转录法 以 mRNA 为模板，借助反转录酶，通过 PCR 仪合成与 mRNA 序列互补的 DNA 片段，然后 在 DNA 聚合酶的作用下合成双链 DNA，从而获得所需要的目的基因。 如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。据图分析： 1.图示分别是哪种方法？是在体内还是体外进行的？ 答案 三种方法分别是：反转录法、直接分离法和化学合成法，都是在体外进行的。 2.三种方法都需要酶，分别是哪些酶？ 答案 方法 a 需要反转录酶和 DNA 聚合酶；方法 b
4、需要限制性内切酶；方法 c 需要 DNA 聚 合酶。 3.三种方法获取的目的基因的碱基对的排列顺序都相同吗？ 答案 不都相同。方法 b 得到的是天然基因，方法 a 得到的目的基因和天然基因相比不含内 含子，方法 c 得到的目的基因的碱基序列可能有多种。 1.下列获得目的基因的方法中需要模板链的是( ) 化学合成法 鸟枪法 反转录法 PCR 扩增目的基因 A. B. C. D. 答案 C 解析 化学合成法是利用 DNA 自动合成仪合成已知核苷酸序列的较小的基因。鸟枪法是用 很多个限制性内切酶去切割 DNA 获得目的基因，和化学合成法一样不需要模板。反转录法 利用 mRNA 作为模板反转录出一条单
5、链 DNA， 然后以这条单链的 DNA 为模板合成出双链的 DNA，也是目的基因。PCR 技术也需要模板。 2.下列有关获取目的基因的方法，叙述错误的是( ) A.从基因组中直接获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性 B.由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工合成的方法获取真核 细胞中的目的基因 C.如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工合成 D.PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成 答案 D 解析 PCR 技术的原理是 DNA 分子的复制，需要耐高温的 DNA 聚合酶催化 DNA 合成，
6、D 错误。 知识拓展 PCR 技术的基本原理和过程 (1)原理：DNA 双链复制。 (2)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。 (3)过程 第一步：加热至 9498 ，DNA 解链为单链； 第二步：冷却至 4060 ，引物结合到互补 DNA 链； 第三步：加热至 72 左右，热稳定 DNA 聚合酶(TaqDNA 酶)从引物起始进行互补链的合成。 如此重复循环多次。 (4)结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为 2n，n 为扩增 循环的次数)。 二、基因表达载体的构建 1.实验：大肠杆菌质粒 DNA 的提取 (1)实验原理 菌体 SDS NaOH 释放 染色体DN
7、A NaOH 变性沉淀 KAc中和不复性 质粒DNA NaOH 变性沉淀 KAc中和复性 离心 上清液：质粒DNA 沉淀：染色体DNA (2)方法步骤 在超净工作台上(或在酒精灯旁)， 取 1 mL 含质粒的大肠杆菌菌液， 接种于 100 mL LB 培养 基中，于 37 摇床振荡培养 810 h，如无摇床可每 0.5 h 用手摇晃一次。 取 1.4 mL 菌液于 1.5 mL EP 管中，以 10 000 rpm 离心 0.5 min，弃上清液。 加 0.1 mL 预冷的溶液，充分混合。 加入 0.2 mL 溶液轻轻翻转混匀，静置 5 min(溶液要现配现用)。 再加入 0.15 mL 预冷
8、溶液，轻轻翻转混匀，静置 5 min。 以 10 000 rpm 离心 20 min，取上清液于另一新 EP 管中。 加入等体积预冷的异丙醇或乙醇，混匀后静置于冰箱的冷冻室 2030 min。 10 000 rpm 离心 15 min，弃上清液。待沉淀稍干后，溶于 50 L 蒸馏水中。 取两支试管，分别加入 1 mL 蒸馏水，其中的一支加入提取的质粒 DNA 溶液，向两支试管 中各加入 1 mL 二苯胺，混匀后，放入沸水中加热 5 min。 待试管冷却后，观察两支试管中溶液颜色的变化发现，加入提取的质粒 DNA 的溶液变蓝， 另一个不变色。 2.基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的原因
9、 单个基因或 DNA 片段导入另一生物体的细胞后，往往会被细胞内的防御系统消灭掉，降 低了目的基因的表达效率。 将目的基因和运载体一起进入受体细胞，可以保护目的基因不被受体细胞识别并破坏。 (2)构建过程 用限制性内切酶切割质粒，使环状质粒出现一个切口，露出 DNA 末端。 用同样的限制性内切酶切割目的基因，暴露出两个与质粒相同的 DNA 末端。 用 DNA 连接酶使质粒和目的基因结合成新的环状质粒 DNA 分子表达载体。 结合下图重组质粒的构建过程分析： 1.图中和分别用哪种酶？ 答案 用限制性内切酶，用 DNA 连接酶。 2.同一种限制性内切酶切割后的质粒和目的基因片段混合后，是不是一定是
10、质粒和目的基因 结合？ 答案 不一定。也可能发生质粒的自我环化或者目的基因的自我环化。 3.重组质粒上除了具有目的基因外，为了方便监测和筛选，还应具备哪种基因？ 答案 遗传报告基因。 3.下列关于图中 P、Q、R、S、G 的描述，正确的是( ) A.P 代表的是质粒 RNA，S 代表的是外源 DNA B.Q 表示限制性内切酶的作用，R 表示 RNA 聚合酶的作用 C.G 是 RNA 与 DNA 形成的重组质粒 D.G 是转基因形成的重组质粒 DNA 答案 D 解析 质粒是很小的环状 DNA 分子，因此 P 是质粒 DNA，S 是外源 DNA，G 是质粒和外源 DNA 通过 DNA 连接酶连接而
11、成的重组质粒；质粒和外源 DNA 需要经过同一种限制性内切 酶切割出相同的黏性末端。 4.如图为基因表达载体的模式图，若结构 X 是表达载体所必需的，则 X 最可能是( ) A.氨苄青霉素抗性基因 B.启动子 C.限制酶 D.DNA 连接酶 答案 B 解析 启动子是该表达载体所必需的，功能是启动插入基因的转录过程。氨苄青霉素抗性基 因可以作为报告基因，但不是必须用它作报告基因。限制酶和 DNA 连接酶都不是表达载体 所需要的。 知识拓展 基因表达载体的构成 目的基因的获得 化学合成法 从基因组中直接分离法 鸟枪法 PCR仪扩增目的基因 反转录法 基因表达载体的构建 启动子 目的基因 终止子 报
12、告基因 1.在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要( ) DNA 连接酶 限制性内切酶 RNA 聚合酶 具有标记基因的质粒 目的基因 四种脱氧核苷酸 A. B. C. D. 答案 A 解析 构建重组质粒时，首先要用限制性内切酶切割含有目的基因的 DNA 片段和运载体， 其次需要用 DNA 连接酶将目的基因与运载体连接；RNA 聚合酶催化转录过程，获得重组质 粒时不需要 RNA 聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为运载体；重组质 粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成 DNA 的原料，获得重组质粒不需要 四种脱氧核苷酸。 2.如图为用于基因工程的一个质粒示意图。用 E
13、coR限制性内切酶切割目的基因和该质粒， 再用 DNA 连接酶连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌，最后将大肠杆菌放在四种培养基 中培养：a无抗生素的培养基，b含四环素的培养基，c含氨苄青霉素的培养基，d含 四环素和氨苄青霉素的培养基。含重组质粒的大肠杆菌能生长的是( ) A.a B.a 和 c C.a 和 b D.b 和 c 答案 B 3.不属于目的基因与运载体结合过程的是( ) A.用一定的限制性内切酶切割质粒，露出黏性末端 B.用同种限制性内切酶切割目的基因，露出黏性末端 C.将切下的目的基因插入质粒的切口处 D.将重组 DNA 引入到受体细胞中进行扩增 答案 D 4.下列哪项不是表达载体
14、所必需的组成( ) A.目的基因 B.启动子 C.终止子 D.抗青霉素基因 答案 D 5.下面是将某细菌的基因 A 导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。 请据图回答： (1)获得 A 有两条途径：一是以 A 的 mRNA 为模板，在_的催化下，合成互 补的单链 DNA，然后在_作用下合成双链 DNA，从而获得所需基因；二 是根据目标蛋白质的_序列， 推测出相应的 mRNA 序列， 然后按照碱基互补配对 原则，推测其 DNA 的_序列，再通过化学方法合成所需基因。 (2)利用 PCR 技术扩增 DNA 时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、 _、4 种脱氧核糖核苷酸和耐热性的 DNA 聚合
15、酶，扩增过程可以在 PCR 扩增仪中 完成。 (3)由 A 和运载体 B 拼接形成的 C 通常称为_。 答案 (1)反转录酶 DNA 聚合酶 氨基酸 脱氧核糖核苷酸 (2)引物 模板(A 基因) (3)基因表达载体 解析 (1)利用反转录法合成目的基因的过程是：以 mRNA 为模板，在反转录酶的催化作用 下合成单链 DNA，然后在 DNA 聚合酶的作用下，合成双链 DNA 分子；根据蛋白质工程合 成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的 mRNA 序列，然后按照碱 基互补配对原则，推测 DNA 中脱氧核糖核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR 过 程中需要酶、底物、模板、引物等条件。(3)目的基因和运载体结合，形成基因表达载体。