1、第第 15 课时课时 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术 学习导航 1.阅读教材 P7778内容，掌握 PCR 技术原理。2.结合教材 P7980内容， 了解 PCR 技术的基本操作过程，讨论 PCR 技术的影响因素。 重难点击 1.简述 PCR 的原理。2.了解 PCR 技术的基本操作过程并讨论 PCR 技术的影响 因素。 一一、PCR 的原理的原理 聚合酶链式反应简称 PCR， 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术， 这项技术中 DNA 复制的 过程和细胞内DNA复制的过程是类似的， 请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识， 分析 PCR 的原理。 1DNA 的平面结构示意图 (
2、1)写出各个标号的名称胞嘧啶；腺嘌呤；鸟嘌呤；胸腺嘧啶；脱氧核糖；磷酸 基团；胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；氢键；碱基对；一条脱氧核糖核苷酸链。 (2)DNA 的两条链是反向平行的， 为了明确表示 DNA 链的方向， 通常将羟基末端称为 3端； 将磷酸基团的末端称为 5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。 答案 左链上 5端，下 3端；右链上 3端，下 5端。 2细胞内 DNA 复制条件分析 条件 组分 作用 模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核糖核苷酸 合成 DNA 子链的原料 酶 解旋酶 打开 DNA 双螺旋 DNA 聚合酶 催化合成 DNA 子链 能量 ATP 为解
3、螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为 DNA 聚合酶提供合成的 3端起点 3PCR 原理与反应过程 (1) PCR 概念：是一种体外酶促合成特定 DNA 片段的技术，它能以极少量的 DNA 为模板， 在几小时内复制出上百万份的 DNA 拷贝。 (2)条件及作用 条件 作用 待扩增的目的 DNA 片段 作为复制的模板 两种人工合成的单链 DNA 片段 合成 DNA 时所需要的特异引物 四种三磷酸脱氧核苷酸 原料 耐热 Taq DNA 聚合酶 酶促作用 缓冲溶液 反应介质 (3)反应过程 变性 温度上升到 9498 时，目的 DNA 双链变性解旋为单链模板。 复性 温度下降到 4060 ，两种引物
4、通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。 延伸 温度上升到 72 左右，溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐热的 TaqDNA 聚合酶的作用下。 根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。 循环： 重复上述的 3 个过程， DNA 片段被不断的扩增。 若开始加入了 N 个 DNA 模板片段， 理论上，循环 n 次后能获得 N 2n个 DNA 片段。 1PCR 原理 PCR 反应与体内 DNA 复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。 答案 不相同。体内 DNA 复制所需引物为 RNA 聚合酶合成的一小段 RNA，但 PCR 反应时 所用引物一般是人工合成的单链 DNA 片段。 2PCR 反应过
5、程 (1)PCR 反应中需要解旋酶和 DNA 聚合酶吗？若需要，则与细胞内 DNA 复制有何区别？ 答案 PCR 反应不需要解旋酶，但需要 DNA 聚合酶。由于 PCR 反应中需要高温使 DNA 解 旋，因此 PCR 所需的 DNA 聚合酶需耐高温。 (2)PCR 的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。 答案 每次循环中先高温解旋， 再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于 Taq DNA 聚 合酶发挥作用。 (3)结合下图分析 PCR 过程中 DNA 复制的方向是怎样的？ 答案 DNA 的羟基(OH)末端为 3端，磷酸基团的末端为 5端。当引物与 DNA 母链通 过碱基互补配对结合后，D
6、NA 聚合酶就能从引物的 3端开始延伸 DNA 链，DNA 的合成方 向总是从子链的 5端向 3端延伸。 归纳总结 PCR 扩增与 DNA 复制的异同 项目 DNA 复制 PCR 扩增 不 同 点 时期 有丝分裂间期或减数分裂 前的间期 任何时期 场所 活细胞内 细胞外 酶 解旋酶、DNA 聚合酶 耐高温的 Taq DNA 聚合酶 引物 有转录，产生 RNA 作引物， 无需人工加入 无转录，无引物产生，需人工 加入两种 DNA 引物 特点 边解旋边复制 先全部解旋后开始复制 缓冲液 不需缓冲液 配制缓冲液代替细胞核液 设备 无 控制温度变化的温控设备 相 同 点 原理 严格遵循碱基互补配对原则
7、 引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物 模板 DNA 的两条链为模板 特点 半保留复制 原料 游离的四种脱氧核苷酸 1下列关于 DNA 复制和 PCR 技术的描述中，正确的是( ) ADNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 5端延伸 DNA 链 BDNA 复制不需要引物 C引物与 DNA 母链通过碱基互补配对进行结合 DPCR 扩增的对象是氨基酸序列 答案 C 解析 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA， 故 DNA 复制需要引物； DNA 聚合酶只能从 3 端延伸 DNA 链，而不能从 5端延伸 DNA 链；引物通过碱基互补配对原则与 DNA 母链相 结合；PCR 扩增的对
8、象是 DNA，而不是氨基酸序列。 2PCR 技术有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛 应用，与细胞内的 DNA 复制相比，PCR 可以快速扩增所需的 DNA 片段，请分析回答下列有 关问题： (1)体内 DNA 复制过程中用解旋酶打开双链 DNA，而 PCR 技术中的解旋原理是 _。 (2)此过程需要一种 Taq DNA 聚合酶，该酶是从_中分离的。 (3)与普通 DNA 聚合酶相比，Taq DNA 聚合酶具有的特性是_。 (4)与体内 DNA 复制相比较， PCR 反应要在_中才能进行， 并且要严格控制_ 条件。 (5)PCR 中加入的引物有_种，加入引
9、物的作用是_。 答案 (1)DNA 的热变性原理 (2)水生耐热细菌 Taq (3)耐高温 (4)一定的缓冲溶液 温度 (5)2 作为 DNA 复制的起点 解析 (1)PCR 技术中用高温使 DNA 分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是 DNA 的热变 性原理。 (2)Taq DNA 聚合酶是从水生耐热细菌 Taq 中提取的。 (3)与普通 DNA 聚合酶相比， Taq DNA 聚合酶在 90 以上的环境中不变性， 具有耐高温的特 性。 (4)PCR 反应需要适宜的温度和 pH，因此 PCR 反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控 制好温度条件。 (5)PCR 需要两种引物，引物的识别位点决
10、定了 PCR 扩增的 DNA 片段。PCR 中加入的引物 一般是一小段单链 DNA，作用是引导 DNA 复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷 酸二酯键，成为 DNA 复制的起点。 易错提醒 与 PCR 原理有关的三个易错点 (1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使 DNA 两条链之间的氢键断开；DNA 聚合酶与 DNA 连 接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。 (2)DNA 聚合酶和 DNA 连接酶： DNA 聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的 3端 上，需要模板；而 DNA 连接酶连接的是两条 DNA 片段的缺口，不需要模板。 (3)PCR 中的解
11、旋过程：PCR 过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温 度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA 加热变性后变为单链，并未分解成单体。 二二、DNA 片段的片段的 PCR 扩增和产物检测扩增和产物检测 DNA 片段的 PCR 扩增可以利用 PCR 热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进 行。阅读教材，完善下列内容： 1DNA 片段的 PCR 扩增 准备：按照 PCR 反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上 移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分 混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 离心：将微量离心管放在离心机上，离心约 10 s，目的是使反应
12、液集中在离心管底部 反应：将离心管放入 PCR 仪中，设置程序进行反应 (1)加入离心管中的物质应包括：模板 DNA、Taq_DNA 聚合酶、4 种三磷酸脱氧核苷酸、2 种引物、缓冲液。 (2)离心管中要加入少量石蜡油，目的是防止反应溶液的挥发。 (3)热循环仪的反应程序应设定为： (4)影响因素：在 PCR 实验中，需要扩增的 DNA 片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中 温延伸的时间越长；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T 含量越多，复性温度就越低，反之引物越长，G、C 含量越多，复性温度就越高，这是因为 G、 C 之间是由 3 个氢键连接，A、T 之间是由
13、 2 个氢键连接。 (5)PCR 过程中，循环次数是不是越多越好？ 答案 不是。Taq DNA 聚合酶在 PCR 扩增过程中存在 110 5的出错几率，而且随着循环次 数的增加，其活性也会逐渐降低。因此，PCR 过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在 2535 个循环。 2扩增产物的检测 (1)原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的 DNA 分子在外加电场的 作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。 DNA 片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大 小，因此大小一致的 DNA 分子会在凝胶的一定位置形成 DNA 条带。 (2)过程 配制质量分数为 1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶
14、板 在 DNA 样品中加入 0.2 倍体积的载样缓冲液混匀 取 20 L 加入样品孔内 80 V 稳压电泳 2040 min 当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源 将胶板浸入溴化乙锭溶液染色 510 min 在紫外透射仪上观察电泳条带 1实验过程分析 (1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？ 答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要 盖严，防止离心过程中脱落或液体外溢。 (2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？ 答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。 (3)PCR 实验中使用的微量离心管、
15、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭 菌，为什么这样操作？ 答案 为避免外源 DNA 等的污染。 2结果检测 (1)实验中为什么要测定 DNA 的含量？ 答案 实际操作过程中会有许多因素影响 DNA 含量，所以需要对 DNA 含量进行测定。 (2)如何判断 DNA 扩增成功？ 答案 可以通过计算 DNA 含量来评价扩增的效果。电泳检测的方法，可以通过在紫外 线下直接观察 DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 (3)PCR 扩增过程可能会出现哪些异常结果？ 答案 样品产物少，或产生新的 DNA。 归纳总结 PCR 扩增 DNA 片段的操作要点 (1)避免外源 DNA 的干扰
16、，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。 (2)缓冲液、酶、DNA 引物和 DNA 模板等如果长期保存，需要在20 冰箱内保存。其中， DNA 引物和 DNA 模板要避免反复冻融，否则容易造成 DNA 的降解。 (3)在用微量移液管混合 PCR 反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污 染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。 (4)为防止 DNA 引物与模板 DNA 在室温非特异性结合进行 PCR 反应，需在冰盒上混合 PCR 扩增体系的各种组分。 (5)为避免反应过程中高温使EP管中的水蒸气溢出管外而导致PCR过程中各种成分的浓度发 生变化，需在 PCR
17、反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。 3使用 PCR 仪具体实验操作顺序应为( ) 设计好 PCR 仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在微量离心管中依 次加入各组分 进行 PCR 反应 离心使反应液集中在离心管底部 A B C D 答案 C 解析 PCR 反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方中的各组分并放于实验台上)移液 混合离心反应。PCR 仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应 了。 4近 20 年来，PCR 技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其 原理是利用 DNA 半保留复制，在试管中进行 DNA 的人工复制(如图)，在
18、短时间内，将 DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。 (1)加热使 DNA 双链间的_键完全打开，称为_；而在细胞中是在 _酶的作用下进行的。 (2)如果只需要大量克隆模板 DNA 中间的某个特定区段，应该加入_种特定的引物。 当温度降低至 40 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在 DNA 聚合酶的作 用 下 ， 只 能 在 引 物 的 _ 端 连 接 脱 氧 核 苷 酸 ， 两 条 子 链 的 延 伸 方 向 都 是 _ _。 (3)PCR 技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜 的_和_，前者由
19、_自动调控，后者则靠_来维持。 (4)通过 PCR 技术使 DNA 分子大量复制，如果将一个用 15N 标记的 DNA 分子放入试管中， 以 14N 标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N 标记的 DNA 分子占全部 DNA 分子总数的比例是_。 答案 (1)氢 解旋 解旋 (2)两 3 从子链的 5端向 3端延伸 (3)温度 酸碱度 PCR 仪 缓冲液 (4)1/8 解析 (1)PCR 技术利用热变性原理使 DNA 双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是 在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR 分为三个基本反应步骤：变性(9498 )、复性(40 60 )、延伸(72 )，
20、其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增 DNA 序列 互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从引物的 3端延伸 DNA 链，则 DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端 延伸。(3)PCR 技术与细胞内的 DNA 复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少 还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个 DNA 分子连续复制四次之后，形成 16 个 DNA 分子， 15N 标记的 DNA 分子有 2 个，则15N 标记的 DNA 分子占全部 DNA 分子总数的比例为 1/8。
21、1PCR 技术最突出的优点是( ) A原理简单 B原料易找 CTaq DNA 聚合酶具有耐热性 D快速、高效、灵活、易于操作 答案 D 解析 PCR 技术最突出的优点是快速、高效、灵活和易于操作；Taq DNA 聚合酶具有耐热性 是实验操作成功的关键。 2符合 PCR 反应条件的一项是( ) 稳定的缓冲液环境 DNA 模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 DNA 聚合酶 DNA 解旋酶 限制性内切酶 温控设备 A B C D 答案 D 解析 PCR 反应模拟的是生物细胞内 DNA 复制的条件， 只是无需解旋酶(可热变性)， 也不需 要基因工程的工具酶(限制性内切酶)。 3下列关于 PCR 的描述中，
22、正确的是( ) PCR 是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增 DNA 利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列 A B C D 答案 D 解析 PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术，在高温条件下，把 DNA 的双链打开，缓 慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的 DNA 聚合酶，同时，还需要引物，从引物的 3端连 接脱氧核苷酸。 4下图所示为 PCR 扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物( ) A第一次循环 B第二次循环 C第三次循环 D第四次循环 答案 A 解析 在 PCR 反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的 DNA 为模板，两条 DNA 链可分别由引物和引物与
23、其结合并在 DNA 聚合酶的作用下延伸， 所以形成的 DNA 中只 有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的 DNA 分子又可作为模板参与反应，所以会形 成 DNA 分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的 产物。 5聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。请回答下列问题： (1)DNA 的两条链是反向平行的，通常将_的末端称为 5端，当引物与 DNA 母 链通过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的_开始延伸 DNA 链。 (2)PCR 利用了 DNA 的热变性原理解决了打开 DNA 双链的问题， 但又导致了 DNA 聚合酶失
24、活的新问题。到 20 世纪 80 年代，科学家从一种 Taq 细菌中分离到_，它的 发现和应用解决了上述问题。要将 Taq 细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基 叫_。 (3)PCR 的每次循环可以分为_三步。假设在 PCR 反应中，只有一个 DNA 片 段作为模板，请计算在 5 次循环后，反应物中大约有_个这样的 DNA 片段。 (4)简述 PCR 技术的主要应用：_ _ _(要求至少答两项)。 答案 (1)磷酸基团 3端 (2)耐高温的 Taq DNA 聚合酶 选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32 (4)遗传疾病的临床诊断、法医鉴定、古生物学、基因克隆和 DNA 序列测定等 解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游 离的磷酸基团， 含羟基的一端是 3端， 含磷酸基团的是 5端。 引物的 5端与模板链的 3 端结合，然后沿着引物的 3端延伸。耐高温的 Taq DNA 聚合酶的发现是实现 PCR 的关键， 该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR 一次循环要经历变性、复性和延伸 三个阶段。