1、第第 8 课时课时 固定化酶的制备和应用固定化酶的制备和应用 学习导航 1.阅读教材 P42内容，了解固定化酶的常用方法。2.结合教材 P4041内容，学习 固定化乳糖酶的制备。3.结合教材 P4243内容，检测牛奶中乳糖的分解。 重难点击 1.尝试制备固定化乳糖酶。2.利用固定化酶检测乳糖的分解产物。 一一、固定化酶及其制备固定化酶及其制备 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。 利用固定化酶技术可以解决这些难题。 1固定化酶 (1)概念：固定化酶又叫固相化酶，是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的 酶。酶的固定化过程是通过化学或物理的
2、手段，将酶束缚在一定的区间内，固定酶分子在此 区间内进行催化作用。 (2)酶的固定方法：根据酶的性质和载体特性需要采用不同的方法，有时还需要将几种方法联 合使用： 是吸附法：是将酶吸附到载体表面。 是载体偶联法：是将酶通过共价键结合到载体的表面。 是交联法：通过把酶交互连接、相互结合从而将酶固定。 是包埋法：是将酶或者细胞包埋在细微的网格里。 (3)固定化酶技术的优缺点 优点：稳定性好，而且与底物和产物容易分离。 缺点：一次只能固定一种酶，不利于催化一系列的反应。 2固定化乳糖酶的制备 (1)实验原理 乳糖酶学名为 D半乳糖苷水解酶，是工业中应用相当广泛的一种酶，较多地应用于乳制 品加工中。很
3、多人小肠黏膜内的乳糖酶活性严重降低，导致乳糖不耐症。用乳糖酶处理部分 乳糖，分解为葡萄糖和半乳糖，可以减少这种症状。 固定乳糖酶用的是凝胶包埋法：凝胶是由丙烯酰胺(Arc)和 N，N甲叉双丙烯酰胺(Bis)形 成的三维网状结构的高聚化合物，将酶和凝胶混合，酶即包埋在凝胶内部的微孔中，从而将 酶固定。 (2)方法步骤 乳糖酶的溶解：准确称取乳糖酶 100 mg，然后将其溶解在 pH7.3 的磷酸缓冲液中，其中单 体 Arc 浓度为质量分数 20%，交联剂 Bis 浓度为质量分数 5%。 聚合：将含有 0.6 mL N，N，N，N四甲基乙二胺和 200 mg 过硫酸铵的 4 mL 磷酸缓 冲液迅速
4、倒入乳糖酶的溶解液中，缓慢搅拌混匀，4 条件下进行聚合反应 30 min。 漂洗：聚合反应完成后形成凝胶，将其用小刀切成小块，用缓冲液洗涤 46 次，04 保存备用。 1固定化酶依据的原理与其优点分别是什么？ 答案 将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；同时，固 定在载体上的酶还可以被反复利用。 2固定化乳糖酶的制备 (1)制备固定化乳糖酶时为什么要用缓冲液配制凝胶单体？ 答案 酶活性易受温度和酸碱度的影响，用缓冲液配制凝胶单体能保持溶液中 pH 的相对稳 定，从而保证实验过程中酶的活性。 (2)漂洗凝胶的目的是什么？ 答案 将凝胶表面没有固定的乳糖酶冲洗干净。 归
5、纳总结 固定化酶及其制备的两点总结 (1)固定化酶的优点 同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； 固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤； 稳定性显著提高； 可长期使用，并可预测衰变的速度； 提供了研究酶动力学的良好模型。 (2)固定化乳糖酶制备过程中的注意事项 乳糖酶溶解时为了保持酶的活性，需使用磷酸缓冲液。 缓冲液反复冲洗一方面针对形成凝胶后表面还有一些酶没有包埋在凝胶内部的微孔中被冲 洗掉，另一方面维持酶的活性。 Arc 和 Bis 都是神经性毒剂，操作过程中注意不要沾到皮肤上和吸入体内，一旦沾到皮肤 上要立即用水冲洗。 聚合反应和试剂的质量有
6、很大的关系，如果在教材规定的时间内还没有聚合完成，可以适 当延长聚合时间。 1下列关于固定化乳糖酶的制备的说法，不正确的是( ) A在乳糖酶的溶解中加入磷酸缓冲液是为了维持 pH 相对稳定，保证乳糖酶的活性 B聚合过程中应将混有各种物质的磷酸缓冲液迅速倒入乳糖酶的溶解液中，缓慢搅拌混匀 C聚合过程中各种物质就放在 40 进行聚合反应 30 min D漂洗过程中用磷酸缓冲液洗涤 46 次，将其表面没有固定的酶冲洗掉，04 保存备用 答案 C 解析 固定化乳糖酶的制备过程中始终都应该是用缓冲液来维持 pH 的相对稳定，以保证酶 不会变性失活；聚合反应形成凝胶的过程应该在温度为 4 条件下进行，而不
7、是 40 。 2下列属于固定化酶应用特点的是( ) 可以被反复利用 有利于酶与产物分离 能自由出入载体 一种固定化酶只催化一 种酶促反应 酶只能用包埋法固定化 A B C D 答案 C 解析 酶被固定后可与产物分离，故可反复使用，但不能自由出入依附的载体；通常情况下 固定化酶种类单一，所以不能催化一系列酶促反应，只催化一种或一类酶促反应；酶的固定 化方法主要包括吸附法，载体偶联法、交联法和包埋法。 一题多变 (1)在实际生产中，固定化酶技术能节约成本的原因是什么？ 答案 固定化酶能被反复利用。 (2)写出如图所示固定化酶的方法。 答案 是交联法，是吸附法，是包埋法。 二二、固定化酶的应用固定化
8、酶的应用 固定化酶在工业生产和医学等方面有着重要的用途，下面我们就利用固定化酶来检测牛奶中 乳糖的分解。 1实验原理 乳糖酶可以将牛奶中的乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，还原糖可和斐林试剂反应产生砖红色化 合物，根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性。 2方法步骤 (1)鲜牛奶的处理：取新鲜牛奶 0.5 kg 放入 1 000 mL 干净烧杯中，8590 巴氏灭菌。将灭 完菌后的牛奶冷却至 4550 ，过滤后平均分为两部分，一部分放入 A 烧杯，另一部分放 到 B 烧杯内作对照。 (2)加酶分解：向 A 烧杯内加入适量的固定化酶制剂，4550 条件下保温 45 min，保温过 程中要用预
9、先灭过菌的玻璃棒每隔一段时间轻轻搅拌。 (3)检测乳糖的分解：保温到时后，将牛奶过滤。用移液管分别取 A 烧杯和 B 烧杯内的牛奶 滤液各 2 mL，放到两支试管中，用移液管取斐林试剂各 2 mL 分别放入被检试管中，然后把 试管放入装有热水的烧杯中，摇动试管，观察试管中溶液颜色的变化。 (4)固定化酶的回收：实验完成后，用缓冲液反复洗涤固定化酶，再用体积分数为 0.05%的双 氧水洗涤，然后于 04 下保存。 3实验现象 两只试管中，砖红色较深的是 A，说明固定的乳糖酶能分解乳糖，产生还原糖。 4固定化酶应用的常见方式 (1)间歇式：每次反应完后，经离心或过滤法收回的酶可以重复使用。 (2)
10、连续式：用固定化酶制成的反应柱进行不间断的重复使用，如图为固定化葡萄糖异构酶的 反应柱示意图。 图中是反应柱，是固定化酶，是分布着小孔的筛板，不允许酶颗粒通过，而反应液可 以自由流出。 1写出乳糖的组成及特点。 答案 乳糖是一种由半乳糖和葡萄糖通过 1,4 糖苷键构成的二糖，它的甜度在甜味糖中最 小，溶解度也最低。 2利用斐林试剂检测还原糖的原理是什么？ 答案 还原糖与斐林试剂沸水浴会出现砖红色沉淀。 3为什么固定化酶要回收？ 答案 因为固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用。 归纳总结 检测牛奶中乳糖的分解实验的注意事项 (1)检测乳糖酶对牛奶的分解时，为了使实验现象更明显，可以适当减少底物鲜
11、牛奶的量或增 加固定化酶的量，或适当延长保温时间。 (2)加酶分解时，温度不宜过高或过低，否则酶变性失活或活性太低，得不到实验结果或不明 显。 (3)酶回收要用缓冲液反复洗涤固定化酶，维持酶的活性；再用体积分数为 0.05%的双氧水洗 涤，达到消毒目的，以防固定化酶被微生物污染；然后于 04 下保存，以备下次再使用。 3下列关于检测牛奶中乳糖的分解实验的相关叙述，错误的是( ) A乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖 B还原糖可与双缩脲试剂反应产生砖红色沉淀 C根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性 D实验步骤：鲜牛奶处理加酶分解检测乳糖的分解固定化酶的回收 答案 B 解析 牛奶中
12、乳糖分解的检测原理是乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖；还原糖可与 斐林试剂反应产生砖红色沉淀；根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性； 实验步骤：鲜牛奶处理加酶分解检测乳糖的分解固定化酶的回收。 一题多变 (1)斐林试剂的组成成分？ 答案 斐林试剂是由质量分数为 10%的氢氧化钠溶液和质量分数为 5%的硫酸铜溶液配制而 成的。 (2)斐林试剂的使用特点？ 答案 现配现用、混合使用。 1目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列哪项属于应用中面临的实际问题( ) A酶通常对强酸、强碱、高温非常敏感，但对有机溶剂不敏感 B酶的结构比较稳定，所以催化功能很高 C酶直接用于生产时可能会混
13、在产物中，影响产品的质量 D直接用于生产中的酶可以多次利用 答案 C 解析 如果直接使用酶或酶制剂，溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本， 反应后酶会混在产物中，影响产品质量。 2下列关于固定化酶技术的说法，正确的是( ) A固定化酶技术就是固定反应物，并将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C固定化酶中的酶无法重复利用 D固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术 答案 D 解析 固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在 一定装置内可以重复利用，缺点是无法同时催化一系列酶促反应；在固定过程中，固定的是 酶而不是反应物，因此 A、B、C 均错误。 3酶的固定方法不包括( ) A将酶吸附在载体表面上 B将酶相互连接起来 C将酶包埋在细微网格里 D将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶 答案 D 解析 加酶洗衣粉中的酶没有固定，不可重复利用。 4.如图表示某同学进行的澄清苹果汁生产实验，下列相关叙述正确的是( ) A生产过程中不需考虑温度和 pH B为防止杂菌污染，图示装置制作完毕后应瞬间高温灭菌 C通过控制阀调节苹果汁流出的速率，保证反应充分进行 D固定化果胶酶不可重复使用，每次生产前应重新填装反应柱 答案 C