1、第第 2 课时课时 微生物的选择与纯培养微生物的选择与纯培养 学习导航 1.阅读教材 P9内容，分析培养基对微生物的选择作用。2.结合教材 P1112“微生 物的分离与纯化实验”， 理解并掌握利用平板划线分离法和涂布分离法来纯化微生物的方法。 重难点击 1.探究培养基对微生物的选择作用。2.掌握微生物分离与纯化的基本操作。 一一、培养基对微生物的选择作用培养基对微生物的选择作用 不同微生物的营养需求不同，因此同一培养基上不同微生物的生长繁殖情况不同，同一种微 生物在不同培养基上的生长繁殖情况也不同。 通过实验探究分析培养基对微生物的选择作用。 1实验探究 利用牛肉膏蛋白胨培养基检测空气中的微生
2、物，利用马铃薯葡萄糖培养基检测桌面上的微生 物。 (1)实验方法 空气 打开无菌平板，让其在空气中暴露 3060 min。 桌面 用一根无菌棉签，先在无菌平板的一个区域润湿，然后用其擦抹桌面，再用此棉签 在平板的另一区域内来回划线。 (2)实验结果 同种培养基上生长的微生物类群主要有：细菌、放线菌、霉菌和酵母菌。 在牛肉膏蛋白胨培养基中细菌的数量多，为优势菌；在马铃薯葡萄糖培养基中霉菌的数量 多，为优势菌。 (3)上述实验说明在科研或工业生产中如果想获得一种培养物应采取的措施是：配制相应的培 养基，采用适当的稀释度，得到某一种微生物的纯培养物，即单菌落。 2归纳分析 (1)菌落概念：微生物的单
3、个菌体或孢子在固体培养基表面上生长繁殖形成的肉眼可见的细胞 群体，称为菌落。 (2)菌落特征：不同种微生物对营养要求不一样，在相应的培养基上可形成大小、形态各异的 菌落(如图)，由图思考： 细菌菌落的特征：湿润、黏稠、易挑起、菌落颜色一致。 酵母菌菌落的特征：外形上与细菌极为相似，但是菌落要大而厚，颜色单调。 霉菌菌落的特征：较疏松、常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍到几十 倍。 (3)利用不同培养基培养、分离微生物 种类 营养需求 pH 范围 适用培养基 细菌 高氮源(CN41) 7.27.6 牛肉膏蛋白胨培养基 酵母菌和霉菌 高碳源(CN161) 56 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
4、 3.选择培养基 根据微生物对营养物质、pH、氧气等要求的不同，在培养基中加入某种化学物质，促进需要 的微生物的生长，或者抑制不需要的微生物的生长，从而淘汰不需要的微生物，分离得到需 要的微生物纯种，这样的培养基称为选择培养基。 1不同种微生物菌落的区别 (1)酵母菌菌落与细菌菌落有何区别？ 答案 酵母菌菌落外形上与细菌极为相似，但比细菌菌落大而厚，颜色也较单调。 (2)霉菌菌落与细菌菌落有何区别？ 答案 霉菌菌落较疏松，常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍到几十倍。 2培养基的采用及原因 (1)培养细菌常采用什么培养基，原因是什么？ 答案 牛肉膏蛋白胨培养基，原因是细菌生长需要的
5、氮源高(C/N 比为 41)，pH 中性或微碱 性(pH7.27.6)，因此培养细菌常采用牛肉膏蛋白胨培养基。 (2)培养酵母菌和霉菌常采用什么培养基，原因是什么？ 答案 马铃薯葡萄糖琼脂培养基， 酵母菌和霉菌生长所需的碳源含量高(C/N 比为 161)， pH 偏酸性(pH56)，因此培养酵母菌和霉菌常采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称 PDA)。 归纳总结 (1)菌落中的微生物是同一类型的，可以看作一个种群，菌落的特征是进行菌种 鉴定的重要依据之一。 (2)常见的选择培养基 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。 加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。 无氮源培养基可以分离固氮微生物。 石油是唯
6、一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。 将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。 1下列关于四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，其中正确的一组是( ) 项目 硝化细菌 乳酸菌 酵母菌 衣藻 能源 氧化 NH3 分解乳酸 固定 N2 利用光能 碳源 CO2 糖类 糖类 CO2 氮源 NH3 N2 N2 NO 3 代谢类型 自养需氧型 异养需氧型 异养需氧型 自养需氧型 A.硝化细菌、乳酸菌 B乳酸菌、酵母菌 C酵母菌、衣藻 D硝化细菌、衣藻 答案 D 解析 硝化细菌能进行化能合成作用，利用 NH3氧化提供化学能，将 CO2和 H2O 合成有机 物，属自养需氧型生物；乳酸
7、菌利用糖类氧化分解，提供能量，以铵盐或硝酸盐为氮源，属 于异养厌氧菌；酵母菌不能利用 N2而是利用铵盐、硝酸盐等为氮源进行异养兼性厌氧代谢； 衣藻能进行光合作用，利用 NO 3为氮源，属于自养需氧型。 2 培养基是人工配制的适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 先用完全培养 基培养混合菌种，然后分别放在 A、B、C 三种特殊培养基上培养，分别得到菌落、 。其中 A 培养基以蛋白质为唯一碳源；B 培养基中缺氮源；C 培养基中成分如下表： 成分 粉状硫 MgSO4 7H2O (NH4)2SO4 FeSO4 KH2PO4 CaCl2 H2O 含量 10 g 0.5 g 0.4 g 0.0
8、1 g 4 g 25 g 1 000 mL 请分析回答： (1)菌落同化作用类型最可能是_。 A光能自养型 B化能自养型 C异养型 DA 或 B (2)如果要获得具有固氮能力的菌株，应选用菌落_；如果要培育获得大量蛋白酶的菌 株，应选用菌落_。 (3)从题中分析可见，生物进化的内在因素是_，对生物生存起重要作用的因素是 _。 问题导析 (1)蛋白酶可水解蛋白质为氨基酸。 (2)当培养基无氮源时，固氮微生物可以进行固氮作用，获得氮源。 (3)题干表格中缺少碳源成分且含硫较多。 答案(1)B (2) (3)遗传和变异 外界环境条件 解析 由题目可知：A 培养基以蛋白质为唯一碳源，则菌落的菌株可合成
9、较多的蛋白酶； B 培养基中缺氮源，只能培养固氮微生物；C 培养基中无碳源且含有大量粉状硫，可培养化 能自养型微生物，所以生物的生存是由外界环境条件决定的。 二二、微生物的分离与纯化微生物的分离与纯化 要研究某种微生物的特性，就要从混杂的样品中分离所需的菌种进行纯培养。阅读教材，试 以大肠杆菌为例探讨微生物分离与纯化的方法。 1实验原理 微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中 的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上，经培 养后，即可得到一个微生物的纯种。 2方法步骤 (1)稀释： 用 1 mL 无菌吸管吸取 1 mL
10、 大肠杆菌培养液， 加入到盛有 9 mL 无菌水的大试管中， 充分混匀， 然后用无菌吸管从此试管中吸取 1 mL 加入另一支盛有 9 mL 无菌水的试管中混合 均匀，依次类推制成 10 1、102、103、104、105、106系列稀释度的大肠杆菌稀释液。 (2)划线或涂布 平板划线分离法 a操作： 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环， 挑取大肠杆菌培养液一环在平板上划线。 b划线方法：平行划线和连续划线。 c平行划线时，第一次划线及每次划线之前都要灼烧接种环，划线结束后也要灼烧接种环， 目的分别是什么？ 答案 项目 第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束时灼烧 目的 杀死接种环上 原有的微
11、生物 杀死上次划线后接种环上 残留的菌种，使下次划线 的菌种直接来源于上次划 线的末端，使每次划线后 菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌 种，避免细菌污染环境和 感染操作者 涂布分离法 a将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 b取不超过 0.1 mL 的菌液，滴加到培养基表面。 c将蘸有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810 s。 d用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。 (3)培养：将接种的平板倒置于培养箱或温室中 37 培养 1624 h。 3接斜面 从单个菌落上挑取少许细胞，接种到斜面培养基上，置于培养箱或温室 37 培养 24 h，菌种
12、长好后，4 保存备用。 1平板划线分离法操作注意事项 (1)平板划线分离法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？ 答案 接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。 划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。 接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。 划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。 (2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。 (3)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答案 划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随 划线次数的增加而逐渐减少，
13、最终分散成单个的细菌。 (4)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？ 答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的 数目，得不到纯化的效果。 2涂布分离法操作注意事项 (1)涂布分离法的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求， 想一想将菌液滴加到培养基上时应如何进行无菌操作？ 答案 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不 要接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火焰附近等。 (2)操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和接种的培养基放在一起培养？未接种的培 养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长
14、，说明了什么？ 答案 培养未接种培养基的作用是对照。 未接种的培养基在恒温箱中保温 12 d 后无菌落生 长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染， 需要重新制备。 归纳总结 平板划线分离法和涂布分离法的比较 平板划线分离法 涂布分离法 特点 操作简单，但是单菌落不易分离 操作复杂，但是单菌落易分离 原理 连续划线。 由于划线后， 线条末端细菌 的数目比线条起始处要少， 每次从上一 次划线的末端开始， 能使细菌的数目随 着划线次数的增加而逐步减少， 最终能 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将 不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体 培养基的表面，进行培养。在
15、稀释度足 够高的菌液里，聚集在一起的微生物将 得到由单个细菌繁殖而来的菌落 被分散成单个细胞，从而能在培养皿表 面形成单个菌落 操作 注意 事项 第一步以及每次划线之前都要灼烧接 种环， 在划线操作结束时， 仍然需要灼 烧接种环。 在灼烧接种环之后， 要等其 冷却后再进行划线， 以免接种环温度太 高杀死菌种 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进 行。 应从操作的各个细节保证“无菌”。 例如，对涂布器等接种器具进行消毒和 灭菌、酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、吸管要 在酒精灯火焰周围等 相同 点 用平板划线分离法和涂布分离法接种的目的是： 使聚集在一起的微生物分散成单 个
16、细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种 3涂布分离法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是( ) A操作前需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落 D操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 答案 C 解析 涂布分离法要先将菌液进行一系列的梯度稀释，A 项正确；只有在稀释度足够高的菌 液中，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，故而 要将不同稀释度的菌液分别涂布平板，B 项正确、C 项错误；在稀释涂布过程中，为防止杂 菌污染，要对培养基和涂
17、布器等进行严格灭菌处理，D 项正确。 一题多变 (1)B 项中不同稀释度的菌液一般涂布几个平板为宜？ 答案 为保证结果准确，每个稀释度的菌液一般涂布 3 个平板，并对结果取平均值。 (2)如何证明该接种过程是成功的？ 答案 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入适宜温度的恒温箱中， 培养 12 h 和 24 h 后，观察培养基上的菌落情况，若未接种的培养基上无菌落生长，则证明操作是成功的； 否则不成功。 (3)题中如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落，原因可能是什么？ 答案 可能是稀释度不够，聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。 (4)如果不进行 D 项操作，培养基上的菌落可
18、能有哪些变化？ 答案 菌落种类和数目增多。 4图甲是涂布分离法中的部分操作，图乙是平板划线分离法操作结果。 下列叙述中，错误的是( ) A甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液 B对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为 102，则所得的菌落可能不是由单一的细 胞或孢子繁殖而成 C乙中培养皿中所得的菌落都符合要求 D乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端 问题导析 (1)对菌液进行稀释时，菌液中菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要越高，菌体 的浓度低时，则稀释的倍数不必太高。 (2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要冷却后才能接触菌种。 (3)平板划线分离法的多次划线中，菌
19、体越来越少，即不同划线处的菌体数目不同，所以形成 的菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成的。 答案 C 解析 灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将 菌体杀死，A 正确；稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B 正确；平板 划线分离法中一般最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这 种菌落才符合要求，C 错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次 划线的末端，目的是使菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢 子繁殖而成，D 正确。 一题多变 稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？ 答案
20、 决定稀释倍数及划线次数的因素是菌液的浓度，如果菌液的浓度较高则需要高倍数的 稀释，所划线次数也要较多，否则就可以低倍稀释或减少划线次数。 拓展提升 两种接种方法中，只有涂布分离法才适合对细菌进行计数的原因 只要稀释倍数足够高，则涂布分离法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成的，即一个 肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落， 可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。 而平板划线分离法中一般除了最后一次划线末端处的菌落是由单一的细菌繁殖而成的，其他 每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适合用 于细菌的计数。 1微生物培养过程中，肉眼鉴别金黄色葡萄球菌和
21、枯草杆菌的重要依据是( ) A细菌的大小、形状、颜色 B菌落的大小、形状、颜色 C有无鞭毛 D培养基的不同 答案 B 解析 微生物的鉴别和分离，一般要用固体培养基，由于不同微生物在固体培养基上长出菌 落的形状、颜色等各不相同，所以可以作为鉴别的标准，因为每一个细菌细胞很小，肉眼无 法看到其颜色、形状等。 2 通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。 在缺乏氮源的培养基上， 大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素，可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入 10%的酚，可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分离出( ) A大肠杆菌 B霉菌 C放线菌 D圆褐固氮菌
22、 答案 A 解析 固氮细菌的生长不需要从培养基中获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长，因 此可分离出圆褐固氮菌；在加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放线菌，可分离出霉菌； 在加入 10%的酚的培养基中，因该培养基能抑制细菌和霉菌的生长，所以可分离出放线菌。 利用上述三种培养基无法分离出大肠杆菌。 3.如图是微生物平板划线分离法示意图， 划线的顺序为 12345。 下列操作方法正确的 是( ) A操作前不用进行任何处理 B划线操作必须在火焰上进行 C在 5 区域中才可以得到所需菌落 D在 1、2、3、4、5 区域中划线前后都要对接种环灭菌 答案 D 解析 划线之前应对接种环灭菌；划线操作在酒
23、精灯火焰旁进行；从 1 区域至 5 区域菌落密 度越来越小，可能会在 3、4、5 区域得到所需菌落。 4利用涂布分离法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因 是( ) A培养基制备过程中被杂菌污染 B接种过程中，无菌操作不符合要求 C系列稀释时，无菌操作不符合要求 D由大肠杆菌的种类不同造成的 答案 D 解析 大肠杆菌培养基中出现了多种菌落，说明污染了杂菌，杂菌可能来自培养基，也可能 是因为操作过程中无菌操作不符合要求。 5下表是从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答下面的问题： 试剂 用量 试剂 用量 牛肉膏/g 5 琼脂/g 20 蛋白胨/g 10 水/mL
24、 1 000 NaCl/g 5 (1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、_和无机盐。上述培养基 配方中能充当碳源的成分是_。培养基配制完成以后，一般还要调节 pH 并对培养基进行_处理。 (2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是_和_。 (3)假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举两项) _ _。 答案 (1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 (2)平板划线分离法 涂布分离法 (3)稀释倍数不 够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌又接着划第二次；培养过程灭菌不严格， 受到微生物的污染 解析 (1)培养微生物的培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。牛肉膏、蛋 白胨既是碳源又是氮源；培养基在接种前必须灭菌处理。(2)微生物常用的接种方法包括平板 划线分离法和涂布分离法。 (3)多种因素都会导致接种的菌种密度较大， 没有形成单一的菌落。