1、第第 3 课时课时 微生物数量的测定微生物数量的测定 学习导航 1.阅读教材 P17内容，概述测定某种微生物数量的方法和步骤。2.结合教材 P15 17“测定土壤中微生物的数量”实验，掌握使用平板菌落计数法测定土壤中微生物的数量。 重难点击 1.掌握测定某种微生物数量的方法和步骤。 2.学会使用平板菌落计数法测定土壤 中微生物的数量。 一一、微生物数量测定的方法和原理微生物数量测定的方法和原理 微生物数量的测定也是重要的微生物技术之一，平板菌落计数法是一种应用广泛的微生物数 量测定方法。 1平板菌落计数法的原理：根据微生物在高度稀释的条件下，固体培养基上所形成的单个菌 落，是由一个单细胞繁殖而
2、成的，即一个菌落代表一个单细胞。 2计算方法：从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是：同一稀释度的菌 落平均数 0.2 稀释度10。 3优缺点 (1)优点：能测出样品的活菌数，可用于微生物的选种与育种、分离纯化及其他方面的测定。 (2)缺点：操作手续烦琐、时间较长、测定值常受各种因素的影响。 4该方法统计的菌落数比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上 观察到的只是一个菌落。 1为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？ 答案 土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释 度进行分离。 2平板菌落计数法 (1)平板菌落计数法根据操
3、作步骤的不同可分为哪两种？ 答案 涂布平板法：用灭过菌的涂布器将一定量(一般为 0.1 mL)的适当稀释过的菌液涂布 在琼脂培养基的表面，然后保温培养直到菌落的出现。记录菌落的数目并换算成每毫升样品 中的活细胞的数量。 倒平板法：将已知体积(0.11 mL)的适当稀释过的菌液加到灭过菌的培养皿内，然后倒入 溶化后冷却至 45 的琼脂培养基，水平晃动混匀，待凝固后保温培养到出现菌落，然后与涂 布平板法同样计数。 (2)平板菌落计数法中换算样品的含菌数依据什么数据换算？ 答案 依据稀释倍数、取样接种量和菌落数。 (3)每隔多少小时统计一次菌落数目？应选取菌落数目何时(稳定时或不稳定时)的记录作为结
4、 果？ 答案 每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 (4)统计菌落时，要求细菌和放线菌每皿的菌落数目范围是多少？霉菌每皿的菌落数目范围是 多少？ 答案 若测定细菌和放线菌，要求每皿以 30300 个菌落为宜，若是霉菌则以每皿 10100 个菌落为宜。 归纳总结 要使平板菌落计数法准确，需要掌握的关键步骤有：严格的无菌操作，否则容易 被杂菌污染；稀释液要充分混匀，吸量准确，否则结果不准确；多做几个重复实验，减少误 差。 1 用平板菌落计数法来统计样品中活菌的数目。 在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统 计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是( ) A菌
5、落数量最多的平板 B菌落数量最少的平板 C菌落数量适中的平板 D取若干个平板菌落数量的平均值 答案 D 解析 用平板菌落计数法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过 程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若 干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌体数的真实值。 2 若某一稀释度下， 平板上生长的平均菌落数为 80， 涂布平板时所用的稀释液体积为 0.1 mL， 稀释液的稀释倍数为 106，则每克样品中的活菌数约为( ) A8108 B8107 C8105 D8106 答案 A 解析 每克样品中的活菌数(80 0.1)106。 二二、
6、土壤中尿素分解菌数量的测定土壤中尿素分解菌数量的测定 土壤中含有种类繁多的微生物，不同微生物的数量有差别，我们通过实验来测定土壤中尿素 分解菌的数量。 1土壤中尿素分解菌培养使用的培养基的配方 成分 用量 尿素 20 g 酵母粉 0.1 g 磷酸二氢钾 9.1 g 磷酸氢二钠 9.5 g 酚红 0.01 g 琼脂 20 g 加热溶解后， 用1 mol/L NaOH溶液调pH 至7.27.4， 补加蒸馏水定容至1 000 mL (1)在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是酵母粉，提供氮源的是尿素，琼脂的作 用是凝固剂。 (2)微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。
7、因此该培养基对 微生物具有选择作用，其选择机制是只有能够分泌脲酶从而以尿素作为氮源的微生物才能在 该培养基上生长。 (3)细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，pH 上升，使酚红变色，菌落 周围变红。可用来鉴定选出的菌落是不是尿素分解菌。 2结合下图分析实验过程和注意事项 步骤 实验操作 操作提示 制备培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿 素为唯一氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 对照， 用来判断选择培养基是否 起到了选择作用 制备土壤样 品稀释液 称取土样 10 g，放入盛有 90 mL 无 菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中， 充分摇 匀；吸取上清液 1 mL，转移至
8、盛有 9 mL 的生理盐水的无菌大试管中， 按照上图流程进行样品的稀释， 依次制 成稀释度为 10 1、102、103、104、 10 5、106 的稀释液 应在火焰旁称取土样； 要充分摇匀 加样 取 10 套无菌培养皿，取 10 4、105和 10 6 每种稀释度分别做 3 个重复平板， 留下一个平板作空白对照。 每皿接种稀 释菌液各 0.2 mL 实验时要对所用的平板、 试管作 好标记。 如培养皿要注明培养基 类型、培养时间、稀释度、培养 物等 倒平板 将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并 冷却至 45 左右的尿素培养基(倒入 量约 15 mL)，平置，待凝 倒平板时要晃动培养皿， 使菌液 和
9、培养基混合均匀 培养 待平板完全凝固后，倒置于恒温箱中 37 培养 在牛肉膏蛋白胨培养基上生长 的菌落数目应明显多于选择培 养基上的数目， 才说明选择培养 基有选择作用 计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在 30300 的平板进行计数。在同一稀释 度下，至少对 3 个平板进行重复计数， 然后求出平均值， 并根据平板所对应的 稀释度计算出样品中细菌的数目 如果学生选取的是同一种土样， 结果相差太远， 教师需要引导学 生一起分析产生差异的原因 1试写出测定土壤中尿素分解菌数量的实验流程。 答案 制备尿素固体培养基制备土壤样品稀释液加样倒平板培养统计菌落数计 算样品中的菌数。 2甲、乙两位同学用平板
10、菌落计数法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为 106 的培养基中，得到以下两种统计结果： (1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为 230，该同学的统计结果是否真实可 靠？为什么？ 答案 不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布 3 个 平板，统计结果后计算平均值。 (2)乙同学在该浓度下涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别为 21、212、256，该同学将 21 舍 去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？ 答案 不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验 过程中可能的影响因素，找出差异的原
11、因，而不能简单地舍弃后进行计数。 (3)某同学在三种稀释度下吸取 0.1 mL 的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下数据，试计 算 1 g 样品的活菌数。 平板 稀释度 平板 1 平板 2 平板 3 10 3 320 360 356 10 4 212 234 287 10 5 21 23 18 答案 10 4的稀释度下取 0.1 mL 涂布的三个平板上的菌落数在 30300 之间， 计算其平均值 为(212234287)/3244。进一步可以换算出 1 g 样品中活菌数为 244 0.1 10 410 2.44108。 (4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？ 答案 当两个或多个细菌连在一
12、起时，平板上观察到的只是一个菌落。 3微生物数量测定的实验设计 (1)如果平板上长出的菌落不是均匀分散的，而是集中在一起，可能的原因有哪些？ 答案 菌体密度太大；倒平板后没有立即摇匀；平板冷凝水太多。 (2)同一个稀释度的 3 个平板上的细菌的数目应该比较接近，如果长出的菌落数差别较大，可 能的原因有哪些？ 答案 取样不准确；稀释不均匀；倒平板操作时培养基温度差别较大等。 (3)实验中的无菌操作主要有哪些？ 答案 培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。称取土壤要在火焰旁进 行。稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。 归纳总结 分离尿素分解菌操作中的注意事项 (1)在实验操作中，
13、每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。 (2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有 30300 个菌落， 这个稀释度细菌一般为 104、 105、106倍稀释液，放线菌一般为 103、104、105倍稀释液，真菌一般为 102、103、104倍稀 释液。 (3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。 (4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布 3 个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落 数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。 3 如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。 据图分析下列叙 述正确的是(
14、) A4 号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为 5 号的 10 倍 B5 号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为 1.7109个 C在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使 菌液与无菌水充分混匀 D某一稀释度下至少涂布 3 个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目高 答案 C 4自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后 进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题： (1)实验步骤 制备稀释倍数为 102、103、104、105、106的系列稀释液。 为了得到更加准确的结果
15、，应选用_法接种样品。 适宜温度下培养。 (2)结果分析 测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事 实更加接近的是_。 A一个平板，统计的菌落数是 230 B两个平板，统计的菌落数是 220 和 260，取平均值 240 C三个平板，统计的菌落数分别是 400、212 和 256，取平均值 289 D四个平板，统计的菌落数分别是 210、260、240 和 250，取平均值 240 一同学在稀释倍数为 106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为 212， 那么每克样品中的 活菌数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为 0.2 mL)_。 用这种方法测定菌体
16、密度时，实际活菌数量要比测得的数量_(填“多”或 “少”)，因为_ _。 问题导析 (1)因为题中操作的目的是对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是涂布 分离法。 (2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成 30300 个菌落。 (3)所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显多于或少于其他几个平板，则说 明该平板不符合要求，应重做或舍弃。 答案(1)涂布分离 (2)D 1.06109个 多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 解析 (1)若对大肠杆菌进行计数，则需要用涂布分离法接种样品。(2)应选取多个菌落数相 差不大的平板进行计数，取
17、其平均值。212 0.21061.06109(个)。因为一个菌落可能 由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。 方法链接 用平板菌落计数法计数微生物的方法 (1)涂布分离法操作要求：按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布 3 个或 3 个以上的平 板。 (2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。 (3)选择可用于计数的平板： 选择菌落数在 30300 之间的平板(相同稀释度的平板均符合该特 点)进行计数，然后取平均值。 1对尿素分解菌进行初步鉴定时，可在培养基中加入( ) A重铬酸钾 B酚红指示剂 CCR D结晶紫 答案 B 解析 对尿素分解菌进行初步鉴
18、定，可在培养基中加入酚红指示剂。 2下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( ) AKH2PO4、Na2HPO4、MgSO4 7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水 BKH2PO4、Na2HPO4、MgSO4 7H2O、葡萄糖、琼脂、水 CKH2PO4、Na2HPO4、MgSO4 7H2O、尿素、琼脂、水 DKH2PO4、Na2HPO4、MgSO4 7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水 答案 A 3请选出下列正确的操作步骤( ) 土壤取样 称取 10 g 土壤，取出放入盛有 90 mL 无菌水的锥形瓶中 吸取 0.1 mL 土 壤溶液进行平板涂布 依次制成 10 1、102、103、104、105、10
19、6稀释度的稀释液 A B C D 答案 C 4从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是( ) A将土壤用无菌水稀释，制备 10 3106土壤稀释液 B将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上 C用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌 D从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株 答案 C 解析 从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液，将不 同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上，用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素 的细菌；从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。 5尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好
20、地被植物利用。生活在土 壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设 计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实 验步骤如图所示。 请分析回答问题： KH2PO4 1.4 g Na2HPO4 2.1 g MgSO4 7H2O 0.2 g 葡萄糖 10 g 尿素 1 g 琼脂 15 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到 1 000 mL (1)此培养基能否用于植物组织培养？_，理由是_。 (2)培养基中加入尿素的目的是筛选_， 这种培养基属于_培养基(依据用途划分)。 (3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中
21、的 _和 _， 实验需要振荡培养， 原因是_。 (4)简述土壤中可分解尿素的细菌的鉴定方法及原理：_ _。 答案 (1)不能 缺少植物激素(或缺少植物需要的各种营养) (2)目的菌 选择 (3)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 (4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，pH 增高，使酚红指示剂变红 解析 配制培养基需要根据培养生物的营养需求情况，确定其成分及比例。植物组织培养需 要有满足植物细胞生长所必需的营养和植物激素等条件，题目所给培养基中缺少植物激素， 不能用于植物组织培养。培养基中加入尿素是为了能够筛选出能分解尿素的细菌，依据用途 划分，此培养基属于选择培养基。尿素提供氮源，葡萄糖提供碳源。在实验中振荡培养可增 加培养液中的氧含量，为培养的目的菌提供必需的氧气。