1、第第 2 课时课时 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 学习目标 1.进行微生物分离。使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细 菌。 2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。 3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实 验原理。4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。 一、实验原理 1.脲和脲酶 (1)脲：又称尿素，是蛋白质降解的产物。人和其他哺乳动物的尿中都含有尿素，大量尿素的 存在会对环境造成污染。 (2)脲酶：降解尿素的酶。 (3)以尿素为氮源的微生物的特点：含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。其利用尿素 的反应式为： (NH2)2C=
2、OH2O 脲酶 2NH3CO2。 2.实验目的 (1)使用专一的培养基(含有尿素)分离专一的细菌(有脲酶的细菌)。 (2)利用指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的反应。 3.实验原理 (1)不同微生物利用的氮源种类不同， 有一些细菌含有脲酶， 通过降解尿素作为其生长的氮源。 (2)尿素在脲酶的作用下降解产生 NH3，使培养基的 pH 升高，培养基中的酚红指示剂变成红 色。 4.两种培养基的比较 项目 全营养 LB 固体培养基 尿素固体培养基 培养基 组成 0.25 g 蛋白胨，0.12 g 酵母提取物， 0.25 g NaCl， 0.5 g 琼脂糖， 25 mL 水 0.025 g 葡萄糖，
3、0.12 g NaCl，0.12 g K2HPO4，0.25 mg 酚红，0.5 g 琼脂糖， 15 mL 水，10 mL 尿素溶液 灭菌 方法 高压蒸汽灭菌 10 mL 尿素溶液采用 G6 玻璃砂漏斗过 滤灭菌，其余用高压蒸汽灭菌，60 时 两者混合 上述属于选择培养基的是尿素固体培养基。用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基的原因是：琼 脂中含有少量含氮化合物，用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，是为了尽可能使 培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被不能以尿素为氮源的细菌 利用，有利于对以尿素为氮源的细菌的筛选。 特别提醒 能在选择培养基上生长的不一定是目的菌 原则上选择
4、培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复 杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生 长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步鉴定。 例 1 (2018 温州高二检测)下列有关尿素培养基的叙述，错误的是( ) A.根据物理性质划分，该培养基属于固体培养基 B.培养基中的唯一氮源为尿素，用以筛选以尿素为氮源的微生物 C.培养基中的酚红，用于鉴别以尿素为氮源的微生物 D.培养基中加入 G6 玻璃砂漏斗过滤的尿素后，要用 500 g/cm2压力(90 以上)灭菌 30 min 答案 D 解析 因为尿素加热会分解，所以应先将培养基
5、经 500 g/cm2压力灭菌 30 min，再添加经过 G6 玻璃砂漏斗过滤后的尿素。 例 2 尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌的 分解作用，才能被植物吸收利用。 某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下表： K2HPO4 NaCl H2O 葡萄糖 尿素 酚红 琼脂 0.12 g 0.12 g 15 mL 0.025 g 2.0 g 0.25 mg 0.5 g (1)分解尿素的细菌都能合成_，该种细菌在生态平衡中起到什么作用？ _。 写出细菌分解尿素的反应式： _。 (2)根据培养基的成分判断， 该同学能否分离出土壤中分解尿
6、素的细菌？_(填“能”或 “不能”)，原因是_ _ _。 (3)尿素在高温下容易分解，因此常用_对尿素进行过滤灭菌，而该器材在进 行过滤灭菌操作前应使用_法进行灭菌。 答案 (1)脲酶 参与了氮循环(或维持氮平衡) (NH2)2C=OH2O 脲酶 2NH3CO2 (2)不能 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含氮化合物，尿素不是唯一氮源，不能选择 出只以尿素为氮源的细菌 (3)G6 玻璃砂漏斗 高压蒸汽灭菌 解析 (1)含有脲酶的细菌通过降解尿素作为其生长的氮源，从而也起到维持生物圈氮元素平 衡的作用，脲酶分解尿素的反应式为：(NH2)2C=OH2O 脲酶 2NH3CO2。(2)从培养基的 成
7、分看，因为含有琼脂，所以不能分离出分解尿素的细菌，因为琼脂是一种未被纯化的混合 物， 内含一定量的含氮化合物， 不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。 (3)尿素在高温下易分解， 应采用 G6 玻璃砂漏斗过滤灭菌，G6 玻璃砂漏斗在使用之前，需采用高压蒸汽灭菌法进行灭 菌。 方法技巧 筛选菌株的原理 (1)原理： 根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、 物理因素的抗性不同而制备培养基。 (2)方法 在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度 的食盐可以筛选出金黄色葡萄球菌。 改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时， 可以
8、分离出能降解石油的微生物；用含无机碳源的培养基分离出自养型微生物。 改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物； 用普通培养基在无氧条件下分离出厌氧型和兼性厌氧型微生物。 二、实验操作与分析 1.实验中的对照设置 (1)实验组：以尿素固体培养基进行培养。 (2)对照组：以全营养 LB 固体培养基进行培养。 2.实验步骤 3.实验结果 培养基 细菌悬液稀释度 10 4 10 5 LB 固体培养基 尿素固体培养基 (1)稀释度为 10 4 的培养基中的平均菌落数多。 (2)在相同稀释度的情况下，尿素培养基中的平均菌落数少于 LB 培养基中的平均菌落数，其 原因是大
9、多数微生物不能利用尿素为氮源。 (3)在尿素培养基上的菌落周围会出现红色的环带。 归纳总结 1.样品稀释的问题 (1)稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时， 培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功 地统计菌落数目的关键。 (2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在 30300 之间，便于 计数。 2.与涂布平板有关的问题 (1)防止培养基外溅：在倒平板的过程中，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，因为空 气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 (2)涂布器的灭菌：玻璃刮刀用 7
10、0%酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒 精的玻璃刮刀在酒精灯火焰上引燃。 (3)设置对照：可排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 3.酚红指示剂的选择 本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色的 pH 范围是 6.48.2，在酸性 条件下呈黄色，碱性条件下呈红色。 以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿 素分解，产生的 NH3使培养基的 pH 升高变成碱性，于是培养基中的酚红指示剂变成红色， 圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。 例 3 (2018 浙江名校“新高考”联盟)请分析回答以下
11、关于分离以尿素为氮源的微生物实 验的问题： (1)脲酶可以催化尿素分解为_，其中碱性物质可以使酚红指示剂变为_。 (2)分离以尿素为氮源的微生物， 培养基配制必须加凝固剂_， 培养基在_ g/cm2 压力下灭菌 30 分钟，冷却至 60 ，加入通过_的尿素溶液，混合均匀待用。 (3)为了从土壤中分离得到以尿素为氮源的微生物，分离效果比较好的操作方法是采用 _，采用该方法分离，土壤溶液必须经过_处理。 答案 (1)NH3和 CO2 红色 (2)琼脂糖 500 G6 玻璃砂漏斗过滤 (3)涂布分离法 稀 释 例 4 (2019 嘉兴模拟)幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素
12、。在 患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下： 配制培养基 灭菌、倒平板 X 培养 观察 请回答： (1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为 Hp 中含有_，它能以尿素 为氮源；若有 Hp，则菌落周围会出现_色环带。 (2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_灭菌。 A.高压蒸汽 B.紫外灯照射 C.70%酒精浸泡 D.过滤 (3)步骤 X 表示_。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液_ 到培养基平面上。菌液稀释的目的是获得_菌落。 (4)在培养时， 需将培养皿倒置并放在_中。 若不倒置培养， 将导致_。 (5)常用的纯化微生物的方法除涂布分离法外，
13、还有_。 (6)临床上用 14C 呼气实验检测人体是否感染 Hp， 其基本原理_。 答案 (1)脲酶 红 (2)D (3)接种 均匀涂布 单 (4)恒温培养箱 无法形成单菌落 (5) 划线分离法 (6)Hp 能将 14C 标记的尿素分解为 NH 3和 14CO 2 解析 (1)幽门螺杆菌中含有脲酶，能将尿素分解成为 NH3和 CO2。NH3为碱性，能使酚红指 示剂呈红色， 故菌落周围会出现红色环带。 (2)尿素在高温下会被分解， 故不能用高温灭菌法， 只能采取过滤的方法。(3)由培养操作步骤可知，X 为接种。接种时，应将菌液均匀涂布在培 养基上。为了获得单菌落，接种前应该稀释菌液。(4)为了形
14、成单菌落还应该将培养皿倒置在 恒温培养箱中。 分离以尿素为 氮源的微生物 实验前的准备 实验目的 实验原理 实验设备、用品及材料 实验过程：倒平板制菌悬液涂布分 离细菌倒置培养菌落数观察 1.判断正误： (1)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是对分离的菌种作进一步的鉴定 ( ) (2)制备土壤悬液，需用无菌水浸润土壤，然后从土壤稀释液底部取样( ) (3)全营养培养基中含有较多菌落，而尿素培养基上含有少量菌落，最可能的原因是全营养培 养基被污染( ) (4)尿素固体培养基配制后需要在 121 (1 kg/cm2压力)下灭菌 15 min( ) (5)分离以尿素为氮源的微生物实验
15、中的 LB 培养基和尿素培养基均为固体培养基( ) (6)筛选微生物时要根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，如筛选分解尿素 的细菌要用尿素作为唯一氮源( ) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 2.(2018 浙江名校协作体联考)下列有关“分离以尿素为氮源的微生物”实验的叙述，正确的 是( ) A.对尿素溶液要使用 70%酒精浸泡灭菌 B.分离出的菌落继续在固体培养基中扩大培养 C.划线分离法比涂布分离法更易获得单菌落 D.培养基中需加琼脂糖作为凝固剂 答案 D 解析 对尿素溶液要通过 G6 玻璃砂漏斗过滤进行灭菌，A 项错误；分离出的菌落需要在液 体培养基中进
16、行扩大培养，B 项错误；涂布分离法比划线分离法更容易获得单菌落，相比较 而言，后者操作简单，C 项错误；由于琼脂中含有氮元素，因此在分离以尿素为氮源的微生 物实验中，凝固剂采用琼脂糖，D 项正确。 3.下列关于微生物培养和利用的叙述，错误的是( ) A.利用涂布分离法既能分离微生物也能对微生物进行计数 B.接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步分散获得单个菌落 C.以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌 D.选择培养基作用的原理都是显现某微生物的特征，以区别于其他微生物 答案 D 解析 涂布分离法能分离纯化微生物，也能对微生物进行计数；连续划线是将聚集的菌种逐 步分散，以获得单
17、个菌落；尿素分解菌的分离和鉴别可以选用以尿素为唯一氮源，且含酚红 的培养基；选择培养基是在培养基中加入某一化学物质或改变某一理化性质，使某一微生物 正常生长，而其他微生物则被杀灭或生长受到抑制，从而选出所需要的微生物。 4.请回答下列有关分离以尿素为氮源的微生物的实验的问题： (1)实验目的是使用含有_的培养基分离能产生_酶的细菌；使用_作为指 示剂，由颜色变化检测酶所催化的反应。 (2)制备尿素固体培养基过程中采用的灭菌方法有_、_。 (3)下图所示为实验过程， 从图中可判断出细菌悬液c的稀释度为_， 用_ 法分离细菌。 (4)下列关于此实验的叙述，错误的是_。 A.土样应从有哺乳动物排泄物
18、的地方取 B.取 10 4、105的土壤稀释液各 0.1 mL，分别涂布于全营养 LB 固体培养基、尿素固体培养 基上 C.将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养 2448 h D.在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌 答案 (1)尿素 脲 酚红 (2)高压蒸汽灭菌法 G6 玻璃砂漏斗过滤法 (3)10 4 涂布分离 (4)D 解析 (1)分离以尿素为氮源的微生物的实验原理是培养基以尿素为唯一氮源，只有能分解尿 素的微生物(能产生脲酶)才能在该培养基上存活，尿素分解后产生 NH3，NH3使酚红指示剂 变成红色。(2)制备尿素固体培养基过程中，尿素溶液的灭菌采用 G6 玻璃砂漏斗
19、过滤，其他 成分采用高压蒸汽灭菌，待冷却至 60 左右，两者混合。(3)分析图示，a 瓶中为 10 2土壤 稀释液，b 瓶中吸取 0.5 mL 土壤悬液注入盛有 4.5 mL 无菌水的试管中，即成 10 3 土壤稀释 液，以此类推，c、d 瓶为 10 4、105 土壤稀释液，经梯度稀释后采用涂布分离法分离细菌。 (4)哺乳动物的排泄物中含有尿素，因此在有哺乳动物排泄物的土壤中含有能够分解尿素的细 菌，A 项正确；用涂布分离法分离细菌时，取 10 4、105 的土壤稀释液各 0.1 mL，分别涂布 于全营养 LB 固体培养基、尿素固体培养基上，B 项正确；涂布后的培养基倒置(防止水滴造 成菌落的
20、污染而无法形成单菌落)于恒温培养箱中，37 恒温培养 2448 h 后即可观察菌落 的形态，C 项正确；原则上尿素培养基只允许以尿素为氮源的微生物存活，但实际上，微生 物的培养是一个非常复杂的过程，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长和繁殖， 因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，D 项错误。 5.尿素是农业生产上常用的一种氮肥，它被土壤中的细菌分解为氨后，才能被植物吸收利用。 这种能分解尿素的细菌体内能够合成脲酶，脲酶能催化尿素水解。 (NH2)2C=OH2O 脲酶 2NH3CO2 若要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤中此类细菌的数目，现在 100 毫升三角
21、 瓶中配制 25 毫升尿素固体培养基，培养基配方如下： 葡萄糖 NaCl K2HPO4 酚红 琼脂 水 尿素溶液 0.025 g 0.12 g 0.12 g 0.25 mg 0.5 g 15 mL 10 mL 请据此回答问题： (1)土样最好从_的地方取得，根据培养基配方判断该培养基能否分离出 土壤中能分解尿素的细菌？_(填“能”或“不能”)，原因是_ _。 (2)测定每克土壤中能分解尿素细菌的数目，常用涂布分离法进行测定。在操作过程中错误的 是_。 A.将涂布器从 70%酒精中取出后需放在酒精灯火焰上灼烧 B.涂布时需转动培养皿以使涂布均匀 C.每一浓度需设多个培养皿进行涂布 D.也可以利用
22、划线分离法进行测定 (3)根据菌落测出的细菌数比实际数值要_(填“高”或“低”)，原因是 _。 答案 (1)有哺乳动物排泄物 不能 琼脂含有氮元素， 尿素不是唯一氮源 (2)D (3)低 培 养基中可能有两个或多个细菌紧挨在一起，共同形成一个菌落 解析 (1)因为哺乳动物排泄物中含有尿素，所以在这些地方的土壤中有较多的能分解尿素的 细菌存在。由于培养基配方中有琼脂，它含有氮元素，尿素就不是唯一氮源了，所以要用琼 脂糖来替代琼脂做凝固剂。(2)划线分离法方法简单，但是不能用于计数。(3)根据菌落测出的 细菌数比实际数值要低，原因可能是稀释倍数不够，在培养基中可能有两个或多个细菌紧挨 在一起，共同形成一个菌落。