1、第第 41 讲讲 无菌操作技术实践无菌操作技术实践 1.（2019 山东泰安模拟）洗衣机内部的环境非常潮湿，洗衣机使用时间越长，内 部滋生微生物的机会就越大。 研究人员利用洗衣机内桶背面的残留物进行了相关 实验。请回答： （1） 要制备固体培养基培养残留物中的微生物， 培养基中一般应含有 。 在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是_。 （2）以下各项中，需要消毒的是 ，需要灭菌的是 。 培养基与培养皿；玻棒、试管，烧瓶和吸管；实验操作者的双手。 （3）为了检测残留物中含有微生物的情况，要将残留物制成水样稀释，然后将 稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称 为 。
2、用该方法统计菌落数时是否需要对照组？ 。为什 么？_。 答案 （1）水，碳源，氮源和无机盐 防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿 造成污染，还可使培养皿表面的水分更好的挥发 （2） （3）稀释涂 布平板法 需要 因为需要判断培养基是否被杂菌污染 2.（2019 四川雅安诊断）微生物的应用范围相当广泛，但优良菌种的选育是基础 和关键，是显著改善和提高产品种类、产量以及品质的先决条件。下图是菌株分 离和筛选的一般流程，据此回答问题。 采样 富集 分离 筛选 （1）采样：土壤有“微生物的天然培养基”之称，在寻找目的菌株时要根 据 。 （2）富集：人为控制条件使目的菌种占优势，同时 其他微生物生长， 例
3、如培养霉菌时需将培养基的 pH 调至 。 （3） 分离： 从物理性质上看， 分离需要配制 培养基， 并采用 法 灭菌，分离过程可采用 接种。 （4）筛选：根据菌落_特征进行鉴定（至 少答两点） 。 解析 （1）不同的微生物对生存环境的要求不同，因此在寻找目的菌株时，要 到相应的环境中寻找。 （2）在微生物富集步骤，要人为控制条件抑制其他微生物生长，并使得目的菌 种占优势，如培养霉菌时需将培养基的 pH 调至酸性，不仅有利于霉菌的生长， 还可以抑制其他杂菌的生长。 （3）分离菌种应该采用固体培养基，常用的接种方法有平板划线法或稀释涂布 平板法；接种菌种前需要利用高压蒸汽灭菌法对固体培养基进行灭菌
4、处理。 （4）不同的菌落具有不同的特征，可以根据菌落的形状、大小、隆起程度、颜 色、透明度等特征进行鉴定。 答案 （1）微生物对生存环境的要求，到相应的环境中寻找 （2）抑制或阻止 酸性 （3）固体 高压蒸汽灭菌 平板划线法或稀释涂布平板法 （4）形状、 大小、隆起程度、颜色、透明度 3.嗜盐菌常分布在晒盐场、盐湖、腌制品中，某生物兴趣小组对嗜盐菌进行了如 下探究和分析，请回答以下问题： （1） 获得嗜盐菌的第一步是从合适的环境中采集菌样， 然后按一定的方法分离、 纯化。培养嗜盐菌的培养基较普通培养基中 含量高。 （2）如图是采用不同接种方法接种嗜盐菌后纯化培养的效果图，其中图 方法不适合用于
5、微生物的计数，出现图 A 结果的原因是在操作时 。在 进行计数时，最终选取菌落数在 范围内的平板进行计数，不能选用菌落 数过多的平板的原因是_。 （3）在实验过程中，无菌操作是非常重要的，对实验过程中使用的玻璃器皿通 常使用 法进行灭菌。 解析 （1）由题意可知，嗜盐菌可以生长在高盐的环境中，故与普通培养基相 比，培养嗜盐菌的培养基中盐含量较高。 （2）获得图 A 所示效果的接种方法为 稀释涂布平板法，获得图 B 所示效果的接种方法为平板划线法，在微生物计数 时应该选用稀释涂布平板法接种。图 A 中菌落集中在平板的某区域，说明在操 作过程中涂布不均匀。在计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数
6、在 30 300 的平板进行计数， 若菌落数过多， 菌落重叠的概率大， 将产生较大误差。 （3） 对玻璃器皿的灭菌通常使用干热灭菌法。 答案 （1）盐（NaCl） （2）B 涂布不均匀 30300 菌落数过多，菌落 重叠的概率大，将产生较大误差（合理即可） （3）干热灭菌 4.（2019 山西太原模拟）反刍动物如牛和山羊，具有特殊的器官瘤胃，瘤胃中 生活着多种微生物，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维 素能力进行了研究，请回答： （1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是 （多选） 。 A.酒精灯 B.培养皿 C.显微镜 D.无菌水 E.接种环 （2）向试管内分装含
7、琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉 球擦净的原因是_。 （3）刚果红可与 形成红色复合物，研究人员在刚果红培养基平板上， 筛选到了几株有透明降解圈的菌落（见图 1） 。图中降解圈大小与纤维素酶的 有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是 （填图中序号） 。 （4）纤维素酶高产菌株在20 长期保存时，菌液中常需加入一定量的 保藏。 （5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株 A 和 B，在不同温度和 pH 条件下 进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见图 2，推测菌株 更适合用于人 工瘤胃发酵，理由是_。 答案 （1） CE （2） 避免培养基污染棉塞 （3） 纤维素 量与活性 菌 2
8、（4） 甘油 （5）B 发酵过程会产热和产酸，B 菌株在较高温度和酸性环境下酶的活 性更高 5. （2019 石家庄重点高中摸底） 牛奶富含矿物质和满足人体生长发育所需的多种 氨基酸，消化率高达 98%。长期饮用牛奶有利于增强体质，但牛奶也是多种病菌 的传播载体。如图是牛奶消毒及细菌检测实验的过程。请回答下列相关问题： （ 1 ） 培 养 基 中 的 蛋 白 胨 为 细 菌 的 生 长 提 供 的 营 养 物 质 主 要 有 （填两个） ，对培养基常采用 法进行灭菌。 （2） 步骤称为 消毒法， 步骤是_。 （3）步骤的接种方法是_。 微生物培养过程中，为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿
9、培养。 （4）将接种后的培养基放入 中培养，36 h 后取出，统计 3 个平板上的 菌落数分别是87、 83和85。 经过消毒后的牛奶中， 细菌数大约是 个/mL。 解析 （1）培养基中的蛋白胨为细菌的生长提供的营养物质主要有碳源、氮源 和维生素；常采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。 （2）图中步骤把牛奶放 在 80 恒温水浴锅中煮 15 min， 采用的是巴氏消毒法， 步骤是梯度稀释。（3） 接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法， 其中只有稀释涂布平板法可以用 于微生物计数。微生物培养过程中，为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿 倒置培养。 （4）将接种后的培养基放入恒温培养箱中，培
10、养 36 h 后，统计 3 个 平板上的菌落数分别是 87、83 和 85，由图可知稀释倍数为 103，因此，经过消 毒后的牛奶中，细菌数大约是（878385）/31038.5104（个/mL） 。 答案 （1）碳源、氮源（和维生素） 高压蒸汽灭菌 （2）巴氏 梯度稀释 （3）稀释涂布平板法 倒置 （4）恒温培养箱 8.5104 6.（2019 四川广安眉山一诊）经人工诱变获得的天冬氨酸缺陷型菌株，菌体自身 不能合成天冬氨酸，必须从外界环境中获取天冬氨酸才能生长繁殖。下图是科研 人员利用“影印法”筛选天冬氨酸缺陷型菌株的部分过程（注：基本培养基中不 含氨基酸，完全培养基中含所有种类的氨基酸）
11、。回答下列问题： （1） 过程接种的方法是 。 待测培养皿中的培养基是 （答“基 本”或“完全”）培养基。 （2）过程是将印在同一块丝绒布上的菌落，先后转印至两个不同的平板上。 该过程应该先转印到 （答“基本”或“完全”）培养基上，原因是 _。 （3） 完成过程的转印并在 28 的培养箱中培养 2 天后，两个平板上出现的菌 落有的相同，有的不同。完全培养基上出现的菌落 A 和菌落 B 中，不可能是天 冬 氨 酸 缺 陷 型 菌 株 的 是 菌 落 （ 答 “A” 或 “B ” ） ， 原 因 是 _。 （4）为了进一步鉴定筛选到的菌株确实是天冬氨酸缺陷型菌株，科研人员又制 备了甲、乙两个平板，
12、这两个平板中营养成分的差异是 。将待鉴定菌种 接种到两个平板中，置于适宜条件下培养一段时间后，若观察到两个平板中菌落 的生长情况是 ，则说明该菌株是天冬氨酸缺陷型菌株。 解析 （1）分析图解可知，过程导致菌落均匀分布，因此该方法为稀释涂布 平板法；两种培养基分别培养是为了筛选出氨基酸缺陷型菌株，因此与基本培养 基相比，待测培养皿中特有的成分有氨基酸，类似于完全培养基。 （2）过程应 将印在丝绒布上的菌落先转印至基本培养基上， 原因是防止基本培养基中混入氨 基酸。 （3）比较基本培养基和完全培养基中的菌落可知，B 菌落在基本培养基上 能生长繁殖，说明它能合成天冬氨酸，不可能是天冬氨酸缺陷型菌株。
13、 （4）为了 进一步鉴定筛选到的菌株确实是天冬氨酸缺陷型菌株， 对照实验的两个平板中营 养成分的差异是是否含有天冬氨酸， 接种后若两个平板中菌落的生长情况是含有 天冬氨酸的平板上生长有菌落，另一个平板上不能生长，则说明该菌株是天冬氨 酸缺陷型菌株。 答案 （1）稀释涂布平板法 完全 （2）基本 防止基本培养基中混入氨基酸 （3）B B 菌落在基本培养基上能生长繁殖，说明它能合成天冬氨酸 （4）是 否含有天冬氨酸 含有天冬氨酸的平板上生长有菌落，另一个平板上不能生长 7.（2019 河南中原名校联考）回答与生物技术实践有关的问题： （1） 为了获得耐高糖、 耐酸特性的酵母菌菌种， 可以对野生菌种
14、进行 。 然后在 （培养基的物理状态）培养基上进行培养。 （2）通过选择培养，人们可以分离得到目的微生物耐高糖、耐酸特性的酵 母菌，选择培养的原则是_。 （3）在用平板划线法接种时，每次划线前都需要对接种环进行灼烧，其目的是 _。 （4）大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，其代谢产物能与染料伊红美蓝 反应，使菌落呈黑色。为检测严重污染水体中的大肠杆菌数量，将水样适当稀释 后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为 的菌落进行计数。该 方 法 是 通 过 统 计 平 板 上 的 菌 落 数 来 推 测 样 品 中 的 活 菌 数 ， 其 原 理 是 。在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养
15、基 放 在 恒 温 箱 中 培 养 一 段 时 间 ， 观 察 是 否 有 菌 落 生 成 ， 其 目 的 是 _。 答案 （1）诱变处理（或紫外线照射或射线照射） 固体 （2）人为提供有利于目的菌生长条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长 （3）杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端 （4）黑色 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品 稀释液中的一个活菌 检测培养基制备是否合格（灭菌是否彻底） 8.为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行 如图 A 所示的实验。 （1） 步骤与步骤中培养基成分相比， 最大的区别是步骤培养基中 。 从功能上
16、讲，步骤中使用的培养基属于 培养基。 （2） 同学甲进行步骤的操作， 其中一个平板经培养后的菌落分布如图 B 所示。 该同学的接种方法是 出现图 B 结果可能的失误操作 是_。 （3）同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤的操作：将 1 mL 样品稀释 100 倍，在 3 个平板上分别接入 0.1 mL 稀释液；经适当培养后，3 个平板上的菌 落数分别为 56、58 和 57。据此可得出每升样品中的活菌数为 个。 （4） 步骤需要振荡培养， 原因是_。 （5）步骤后取样测定石油含量的目的是_。 解析 （1）步骤与步骤中培养基成分相比，最大的区别是步骤中使用的 培养基内石油是唯一碳源。步骤使用的
17、培养基中只有石油一种碳源，不能降解 石油的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。 （2）根据图 B 平板经培养后的菌落分布可知，该同学的接种方法是稀释涂布平板法。平板上菌 落聚集分布，出现这种结果可能的失误操作是涂布不均匀。 （3）每升样品中的活 菌数（565758）/3101001 0005.7107（个） 。 （4）振荡可使菌体 与培养液充分接触，并且提高培养液中（溶解）氧的含量，提高营养物质的利用 率。 （5）为了筛选出分解石油能力最强的细菌，步骤后取样测定石油含量，选 取石油含量最低的培养基中的菌种。 答案 （1）石油是唯一碳源 选择 （2）稀释涂布平板法 涂布不均匀 （3） 5.7107 （4）提高培养液中（溶解）氧的含量，通过振荡可使菌体与培养液充 分接触，提高营养物质的利用率 （5）筛选出分解石油能力最强的细菌