1、第第 3 课时课时 导入导入、检测和鉴定目的基因检测和鉴定目的基因 学习导航 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。 重难点击 1.目的基因导入受体细胞的方法。2.检测和鉴定目的基因的方法。 方式一 通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取及基因表达载体的构建。 在目的基因与载体连接成重组 DNA 分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进 行扩增和筛选，获得大量的重组 DNA 分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 由于外源基因与载体构成的重组 DNA 分子性质不同、宿主细胞不同，将重组 DNA 导入宿主 细胞的具体方法也不
2、相同。 方式二 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和 鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正 能够摄入重组 DNA 分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是 否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素 抗性基因，当这种质粒与外源 DNA 组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可 以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组 DNA 分子 进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 一、导入
3、目的基因一、导入目的基因 将目的基因导入受体细胞的方法和过程 受体 细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用 方法 农杆菌转化法 显微注射法 感受态细胞法 过程 将目的基因插入 Ti 质粒 的 TDNA 上农杆菌 导入植物细胞整合 到受体细胞染色体的 DNA 上表达 将含有目的基因的表达 载体提纯取卵(受精 卵)显微注射受精卵 发育获得具有新性状 的动物 Ca2 处理细胞感受态 细胞重组的基因表达 载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 分子 1农杆菌转化法的分析 (1)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 答案 将基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用 Ca2
4、 处理农杆菌细胞，使其处于 感受态，利于重组质粒的导入。 (2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入 到 Ti 质粒的 TDNA 上？ 答案 农杆菌中的 Ti 质粒上的 TDNA(可转移的 DNA)可转移至受体细胞， 并且整合到受体 细胞的染色体 DNA 上。 2植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 答案 植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可 以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用 受精卵。 3为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细
5、胞？ 答案 微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。 1农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中 得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农杆菌自然条件下感染植物的特 点，能实现_ _。 具体原理是在农杆菌的 Ti 质粒上存在 TDNA 片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受 体 细 胞 _ 上 的 特 点 ， 因 此 只 要 将 携 带 外 源 基 因 的 DNA 片 段 插 入 到 _(部位)即可。 (2)根据 TDNA 这一转移特点，推测该 DNA 片段上可能含有
6、控制_ 酶合成的基因。 (3)图中 c 过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是_类化合物。 (4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外， 还可采取_(至少写 出两种)。 答案 (1)单子叶植物 将目的基因导入植物细胞 染色体的 DNA TDNA 片段(内部) (2)DNA 连接酶、限制 (3)酚 (4)基因枪法、花粉管通道法 解析 (1)一般农杆菌不能感染单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性， 可实现将目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的 DNA 上的是农杆菌 TDNA 片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据 TDNA 这一转移特
7、点，可以推测该 DNA 片段能控制合成 DNA 连接酶、限制酶以实现与双子叶植物 细胞染色体 DNA 的整合。 (3)植物细胞受伤后可产生酚类物质， 促进农杆菌向植物细胞转移。 (4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。 一题多变 判断正误： (1)获得上述转基因植物的核心步骤是 a( ) (2)用含有重组 Ti 质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，从而把目的基因导入植物细胞，在这 个过程中所有细胞都导入了目的基因( ) (3)在过程 a 中只需要 DNA 连接酶参与( ) (4)用含有重组 Ti 质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，要经过植物组织培养才能获得表现出 新性
8、状的植物( ) (5)因病毒能够侵染正常细胞，有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上，所以 动植物病毒也可作为基因工程的载体( ) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) 易错点拨 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 TDNA 的中间部位，第二次拼接(非人工操作) 指被插入目的基因的 TDNA 拼接到受体细胞染色体的 DNA 上；第一次导入是将含目的基 因的 Ti 质粒重新导入农杆菌， 第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 TDNA 导入受体 细胞。 2下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( ) A基因枪法导入植物体
9、细胞的方法比较经济和有效 B显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变 D农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 答案 A 解析 不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物细胞 常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是 显微注射法；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞 的生理状态发生改变，完成转化。 二、检测和鉴定目的基因二、检测和鉴定目的基因 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能 知道。
10、 1DNA 水平检测：采用 DNA 分子杂交法。主要做法是用放射性同位素标记的已知 DNA 片段作基因探针检测受体细胞。如果能发生特异性结合，说明目的基因已经插入转基因生物 染色体的 DNA 中。 2RNA 水平检测：采用分子杂交技术。用已标记的目的基因作为探针与待测生物体内提取 的 mRNA 分子杂交，观察是否出现杂交带。 3蛋白质水平检测：采用抗原抗体杂交法。从待测转基因生物中提取蛋白质， 用相应的 抗体进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达了。 4个体水平检测：对个体的生物学特定性状进行检测。 1观察目的基因的检测示意图(如上图所示)，回答下列问题： (1)检测转基因生物的染色体
11、 DNA 上是否插入了目的基因， 采用 DNA 分子杂交技术。 这种技 术的主要做法是什么？ 答案 主要做法是用标记了放射性同位素的目的 DNA 片段作为探针，检测受体细胞的 DNA 中有无目的基因。显示出杂交带，说明目的基因已经插入染色体 DNA 中。 (2)DNA 分子杂交的原理是什么？除了用于目的基因的检测与鉴定以外，试举例说明还有哪 些应用？ 答案 碱基互补配对原则。还可用于亲子鉴定、刑事侦察、生物亲缘关系确定等。 (3)检测目的基因是否转录出了 mRNA，采用分子杂交技术，这种技术与 DNA 分子杂交技术 有何异同？ 答案 相同之处是都采用分子杂交技术，不同之处是从转基因生物中提取的
12、是 mRNA，同样 用标记的目的基因作探针，与 mRNA 杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了 mRNA。 (4)检测目的基因是否翻译出蛋白质的方法是什么？其原理是什么？ 答案 抗原抗体杂交法。原理是抗原能与相应抗体特异性结合。 2检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？ 答案 用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。 归纳总结 关于不同分子检测的原理、场所、探针的异同 (1)原理：转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转 基因生物的基因组 DNA，而是转基因生物细胞内的 mRNA；翻译水平的检测，则是利用抗 原与抗体特异性结合的原理。 (
13、2)场所：不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。 (3)探针：在 DNA 分子、mRNA 分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的 探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的 DNA 片段。 3目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才 能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( ) 检测受体细胞的染色体上是否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的 基因是否转录出了 mRNA 检测目的基因是否翻译出了蛋白质 A B C D 答案 C 4判断正误： (1)如果检测出标记基因表达的性状，说明载体已导入受体细胞( ) (
14、2)检测目的基因是否翻译成蛋白质是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键( ) (3)DNA 探针用来检测目的基因是否导入( ) (4)鉴定转化的基因是否成功表达，在分子水平上可应用的方法是抗原抗体杂交( ) 答案 (1) (2) (3) (4) 题后归纳 目的基因的检测与鉴定的方法汇总 1将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，应分别采用的方法是( ) A显微注射法 农杆菌转化法 B基因枪法 花粉管通道法 C农杆菌转化法 显微注射法 D基因枪法 显微注射法 答案 D 解析 玉米是单子叶植物，对单子叶植物来说，导入目的基因常用的方法是基因枪法；对于 动物细胞来说，导入目的基因常用的方法是
15、显微注射法。 2下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X 是获得外源基因并能够表达的细胞。下列有关 说法不正确的是( ) AX 是能合成胰岛素的细菌细胞 B质粒是细胞核或拟核外能自主复制的小型环状 DNA C目的基因与质粒的重组只需要 DNA 连接酶 D该细菌的性状被定向改造 答案 C 解析 据分析可知，重组质粒导入的是细菌细胞，所以 X 是能合成胰岛素的细菌细胞，A 正 确；质粒是一种常用载体，是在细胞核或拟核外能自主复制的小型环状 DNA，B 正确；基因 与载体的重组需要限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶，C 错误；基因工程的特点是能够定向 改造生物的性状，D 正确。 3下列关于基因表达载体
16、导入微生物细胞的叙述中，不正确的是( ) A常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较 少 B受体细胞所处的一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态称为感受态 C感受态细胞吸收 DNA 分子需要适宜的温度和酸碱度 D感受态细胞吸收重组表达载体 DNA 分子的液体只要调节为适宜的 pH 即可，没必要用缓 冲液 答案 D 解析 将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件(如适宜的温度、pH 等)下，将基因 表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过程中，可能会影响 pH 的变化，因此要 加入缓冲液，以维持适宜的 pH。 4检测转基因生物染色体 DNA 上
17、是否插入了目的基因的常用方法是( ) ADNA 分子杂交技术 B荧光分子标记技术 C放射性同位素标记技术 D显微注射技术 答案 A 解析 检测目的基因常采用 DNA 分子杂交技术， 即在含有目的基因的 DNA 片段上用放射性 同位素进行标记， 以此作为基因探针， 并使基因探针与基因组 DNA 杂交， 若显示出杂交带， 则表明目的基因已插入染色体 DNA 中。 51957 年，生物学家了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，这种因子能作用于其他细 胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素；从 1987 年开始，用基因工程方法生产的干扰素 进入了工业化生产，并且大量投放市场。请回答下列问题： (1)若
18、已知干扰素的氨基酸序列，则获取目的基因的较简单方法是_； 目的基因还可以从_文库中获取，而从 cDNA 文库中不一定能得到，原因是 _ _。 (2)用限制酶处理质粒和目的基因后，用_酶处理，可形成基因表达载体，该载 体的化学本质是_。 (3)转基因技术是否成功，需要对受体细胞进行分子水平的检测，首先是检测受体细胞 _上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。 检测方法是采用_。 最后还要检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，利用的技术是_。 答案 (1)人工合成法 基因组 cDNA 是由生物发育的某个时期的 mRNA 逆转录产生的(其 他合理答案也可) (2)DNA 连接 DNA (3)染色体的 DNA DNA 分子杂交法 抗原抗体 杂交技术 解析 (1)若已知干扰素的氨基酸序列，则可以通过人工合成的方法获得目的基因；cDNA 文 库是部分基因文库， 因为cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的， 所以cDNA 文库中不一定有目的基因，最好从基因组文库中获取。(2)用限制酶处理载体和目的基因后， 将目的基因与载体连接，需要使用 DNA 连接酶处理，基因与载体的化学本质是相同的，都 是DNA。 (3)检测目的基因使用DNA分子杂交法； 检测蛋白质采用的是抗原抗体杂交技术。