1、第第 2 课时课时 获取目的基因获取目的基因、构建基因表达载体构建基因表达载体 学习导航 1.概述获取目的基因的方法，特别说明 PCR 的原理。2.结合图 110，说出基因 表达载体的构建。 重难点击 获取目的基因的途径及基因表达载体的构建。 方式一 抑制疾病传播的转基因蚊子 巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、 丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育 出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因 的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从
2、而减 少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们 一起来学习基因工程的基本操作程序吧！ 方式二 师：出示我国有知识产权的转基因抗虫棉的培育图解： 问：转基因抗虫棉的培育需要哪些步骤？ 学生看图并回答：首先要获得目的基因，其次将目的基因连接到 Ti 质粒上，然后将重组的 Ti 质粒导入受体细胞，最后要重建转基因植物。 根据学生回答补充：还需检测抗虫基因是否已经进入棉花植株，并由此引出基因工程的四部 曲。 一、获取目的基因一、获取目的基因 1通过基因文库获取目的基因 (1)概念 先用酶切等方法将某种生物细胞的整个基因组 DNA 切割成大小合适的片段，再将这些片
3、段 分别和载体连接起来，导入受体菌的群体并储存起来，每个受体菌可能分别含有这种生物的 不同基因，这个群体称为基因文库。 (2)种类 基因组文库：包含某种生物全部基因的基因文库 部分基因文库：包含某种生物部分基因的基因文库 2通过 PCR 技术扩增目的基因 (1)原理：DNA 分子半保留复制。 (2)基本过程 加入反应物质：在离心管中加入所需要的模板 DNA、引物、4 种脱氧核苷酸以及 TaqDNA 聚合酶。 变性：加热至 94 ，使 DNA 中的氢键断裂，双链解开。 退火(复性)：冷却到 55 ，引物与单链 DNA 相应互补序列结合。 延伸：加热至 72 左右，在 TaqDNA 聚合酶的作用下
4、，沿模板延伸子链，最终合成 2 条 DNA 分子。 (3)若 PCR 过程中，扩增循环的次数是 n，则目的基因的量将被扩增 2n倍。 (4)PCR 技术中因为需要在高温下进行，因此 TaqDNA 聚合酶需要具有热稳定性。 3通过化学方法直接人工合成目的基因 如果目的基因较小，脱氧核苷酸序列又已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合 成。 1从基因文库中获取目的基因 (1)cDNA 文库是从某种生物的某一细胞中提取出 mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为 什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？ 答案 由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出 mRNA，所以由 该
5、细胞中的 mRNA 逆转录得到的基因文库仅含该生物的部分基因。 (2)结合概念，从范围上比较基因组文库和 cDNA 文库(部分基因文库)之间的大小关系：基因 组文库cDNA 文库。 (3)基因文库的组建过程所包含的基因工程的步骤 目的基因的获取：将某种生物体内的 DNA 全部提取出来，选用适当的限制酶，将 DNA 切 成一定范围大小的 DNA 片段。 重组质粒的构建：将所获得的 DNA 片段分别与载体连接起来。 目的基因导入受体细胞：将重组质粒导入受体菌的群体中储存。 2PCR 技术与 DNA 复制的比较 比较项目 DNA 复制 PCR 技术 区 别 解旋方式 解旋酶催化 DNA 在高温下变性
6、解旋 场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在 PCR 扩增仪中) 酶 解旋酶、DNA 聚合酶 热稳定的 DNA 聚合酶 温度 细胞内温和条件 控制温度，需在较高温度下进行 结果 合成 DNA 分子 合成 DNA 片段或基因 联系 (1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 (2)原料：均为四种脱氧核苷酸 (3)酶：均需 DNA 聚合酶 (4)引物：都需要引物，使 DNA 聚合酶从引物开始进行互补链 的合成 归纳总结 两种人工合成目的基因的方法比较 (1)逆转录法 主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的 mRNA 为模板，借助 逆转录酶合成碱基互补的单链 DNA，
7、然后在 DNA 聚合酶的作用下合成双链 DNA。 其过程如 下图所示： 目的基因的mRNA 逆转录 单链DNA 合成 双链DNA即目的基因 (2)化学合成法 即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。 其过程如下图所示： 蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因 由于真核细胞的基因含有不表达的 DNA 片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在 获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的方法。 1为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻 品种。下图是获
8、取植酸酶基因的流程。据图回答下列问题： (1)B 过程需要的酶是_。 (2)图中基因组文库_(填“小于”“大于”或“等于”)cDNA 文库。 (3)目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中_和_为 模板直接进行 PCR 扩增，该过程中所用酶的显著特点是_。 答案 (1)逆转录酶 (2)大于 (3)DNA cDNA 耐高温 解析 B 过程是以 RNA 为模板合成 DNA 的逆转录过程，需要的酶是逆转录酶；目的基因 和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中 DNA 和 cDNA 为模板直接进行 PCR 扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。 一题多变 判断正误： (1)直接分
9、离目的基因的方法其优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性( ) (2)由于真核细胞的基因含有不表达的 DNA 片段，一般使用人工合成的方法( ) (3)目前人工合成目的基因的方法主要有两种，分别是逆转录法和化学合成法( ) (4)PCR 技术的原理是 DNA 复制，需要 RNA 聚合酶催化 DNA 合成( ) 答案 (1) (2) (3) (4) 解析 PCR 技术扩增的原理是 DNA 半保留复制， 需要耐高温的 DNA 聚合酶催化， 并以脱氧 核苷酸为原料。 易错辨析 认清基因组文库法与逆转录法获取目的基因的不同 (1)酶：前者需要限制酶；后者需要逆转录酶。 (2)原料：前者不需要
10、原料；后者需要脱氧核苷酸。 (3)结构：前者基因中含有启动子，能转录；后者基因中没有启动子，只将编码序列导入受体 细胞，故无法进行转录。 2以下为形成 cDNA(图中的单链 DNA)过程和 PCR 扩增过程示意图。据图分析，下列说法 正确的是( ) A催化过程的酶是 RNA 聚合酶 B过程发生的变化是引物与单链 DNA 结合 C催化过程的酶都是 DNA 聚合酶，都能耐高温 D如果 RNA 单链中 A 与 U 之和占该链碱基含量的 40%，则一个双链 DNA 中，A 与 U 之 和也占该 DNA 碱基含量的 40% 答案 B 解析 由题意可知，分别表示逆转录、DNA 的复制、DNA 解旋、引物结
11、合到互 补 DNA 单链及互补链的合成，B 正确；过程由逆转录酶催化完成，A 错误；催化过 程的酶都是 DNA 聚合酶，过程是在 72 的高温条件下进行的，该过程中的酶需耐高温， 催化过程的酶不耐高温，C 错误；在 DNA 分子中有 T 无 U，D 错误。 3如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( ) A三种方法都需要酶并均在体外进行 B碱基对的排列顺序均相同 C三种方法均属于人工合成法 D方法 a 不遵循中心法则 答案 A 解析 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法 a 需要逆转录酶和 DNA 聚合酶，方 法 b 需要限制酶，方法 c 需要 DNA
12、聚合酶)，A 正确；通过方法 a 得到的目的基因不含有内 含子，通过方法 c 得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此碱基对的排列顺序不 都相同，B 错误；图示 a 和 c 属于人工合成法，而 b 是从供体细胞的 DNA 中直接分离目的基 因的方法，C 错误；方法 a 遵循中心法则，D 错误。 二、构建基因表达载体二、构建基因表达载体 基因表达载体的构建(如图) 1启动子：位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是 RNA 聚合酶识别、结合的部位，能驱 动基因转录合成相应的 mRNA。 2终止子：是一段特殊的 DNA 片段，是载体上终止目的基因转录的核苷酸序列。 3标记基因：是为了鉴别受体细胞中是否
13、含有目的基因。常用的标记基因主要是抗性基因、 某些生化表型基因。 4目的基因：目的基因插在启动子和终止子之间。 结合基因表达载体模式图分析以下问题： 1用字母和文字表示基因表达载体的组成。 答案 基因表达载体的组成：a启动子b终止子c标记基因d复制原点e目的基 因。 2启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？ 答案 不是一回事，启动子和终止子位于 DNA 上，是基因表达载体必需的部分。而起始密 码子和终止密码子位于 mRNA 上，决定翻译的开始和结束。 3为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？ 答案 启动子使转录开始，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使 转
14、录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。 4下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶 切位点。请据图回答下列问题： 限制酶 BamH Hind EcoR Sma 识别序 列及切 割位点 (1)结合下图重组质粒的构建过程分析： 图中为同一种限制酶，为 DNA 连接酶。 (2)构建基因表达载体时，能否用 Sma酶切割质粒？为什么？ 答案 不能。因为 Sma会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因。标记基因 用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若被破坏， 无法进一步筛选。 (3)与只使用 EcoR相比较，使用
15、BamH和 Hind两种限制酶同时处理质粒、外源 DNA 的 优点是什么？ 答案 可以防止质粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身环化。 归纳总结 (1)选用同一种限制酶切割目的基因和载体的原因：选用同一种限制酶切割会产 生相同的黏性末端，可以在 DNA 连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。 (2)基因工程操作时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体的原因：如果用一 种限制酶切割，目的基因两侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能 会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只 有载体与目的基因的连接。如果用两种不同的限制酶进
16、行切割就可以有效避免载体与载体 以及目的基因与目的基因的连接，提高连接的有效性。 4下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是( ) A基因表达载体的构建是在生物体外完成的 B任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别 C图中启动子位于基因的首端，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位 D抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因 答案 B 解析 由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同， 所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。 5 如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图
17、， 其中 Pst、 Sma、EcoR、Apa为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是( ) A图示过程是基因工程的核心步骤 B表达载体构建时需要用到限制酶 Sma C抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 答案 B 解析 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤；构建过程中需要将 目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶 Pst、EcoR，限制酶 Sma不可用，它会破 坏目的基因的完整性；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的 细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等
18、。 1基因工程的基本操作程序有：使目的基因与载体相结合；将目的基因导入受体细胞； 检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；获取目的基因。正确的操作顺序是( ) A B C D 答案 C 解析 基因工程的主要操作步骤顺序是：获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导 入受体细胞目的基因的检测和鉴定。 2如图为基因表达载体的模式图，若结构 X 是表达载体所必需的，则 X 最可能是 ( ) A氨苄青霉素抗性基因 B启动子 C限制酶 DDNA 连接酶 答案 B 解析 启动子是该表达载体所必需的，它应位于插入基因的前端，功能是启动插入基因的转 录过程。 3以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方
19、法，下列说法中错误的是( ) A甲方法可建立该细菌的基因组文库 B乙方法可建立该细菌的 cDNA 文库 C甲方法要以脱氧核苷酸为原料 D乙方法需要逆转录酶参与 答案 C 解析 甲方法是从细菌的 DNA 中直接提取，故可以建立该细菌的基因组文库；乙方法是由 mRNA 逆转录获取目的基因，故可以建立该细菌的 cDNA 文库；乙方法需要逆转录酶并以脱 氧核苷酸为原料。 4下列有关 PCR 技术的说法，不正确的是( ) APCR 技术的原理是 DNA 分子半保留复制 BPCR 扩增中必须有解旋酶才能解开双链 DNA CPCR 是一项在生物体外复制特定的 DNA 片段的核酸合成技术 D利用 PCR 技术
20、获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 答案 B 解析 PCR 扩增中不使用解旋酶，而是利用高温破坏氢键解开双链 DNA 的，B 错误。 5下图为含铁量较高的转基因水稻的培育过程示意图，请分析回答下列问题： (1)获得铁结合蛋白基因有两条途径：一是以铁结合蛋白基因的 mRNA 为模板，在逆转录酶 的催化下，合成互补的单链 DNA，然后在_作用下合成双链 DNA，从而获得所需 基因；二是根据目标蛋白质的_序列，推测出相应的 mRNA 序列，再推测其 DNA 的序列，利用_(仪器)合成目的基因。 (2)重组 Ti 质粒的结构除了含有标记基因、目的基因、终止子和复制原点外，还必须有 _，它是_结合的部位。 答案 (1)DNA 聚合酶 氨基酸 DNA 合成仪 (2)启动子 RNA 聚合酶