1、第第 10 课时课时 分子生物学技术分子生物学技术 学习导航学习导航 1.结合教材了解 PCR 技术的基本操作。2.理解 PCR 扩增 DNA 片段的原理。 3.结合教材，尝试进行目的 DNA 片段的体外扩增。 重难点击重难点击 1.了解 PCR 技术的基本操作。2.理解 PCR 的原理。 一、一、PCR 反应程序及原理反应程序及原理 1DNA 分子的结构 (1)写出各个标号的名称：胞嘧啶；腺嘌呤；鸟嘌呤；胸腺嘧啶；脱氧核糖；磷 酸基团；胸腺嘧啶脱氧核苷酸；氢键；碱基对；一条脱氧核苷酸链。 (2)DNA 的两条链是反向平行的，为了明确表示 DNA 链的方向，通常将 DNA 的羟基末端称 为 3
2、端，将磷酸基团的末端称为 5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。 答案 左链上 5端，下 3端；右链上 3端，下 5端。 2细胞内 DNA 复制条件分析 条件 组分 作用 模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成 DNA 子链的原料 酶 解旋酶 打开 DNA 双螺旋 DNA 聚合酶 催化合成 DNA 子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为 DNA 聚合酶提供合成的 3端起点 3PCR 技术 (1)概念：在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列(目的 DNA 片段)的技术称为 PCR 技术。 (2)物质条件：DNA 模板、四种脱氧核苷酸、Ta
3、qDNA 聚合酶、引物。 (3)PCR 反应的过程及结果 PCR 反应程序 a变性：在 94 高温下，作为模板的双链 DNA 解旋为单链 DNA。 b退火(复性)：反应体系的温度降至 55 ，引物与作为模板的单链 DNA 上的特定部位相互 配对。 c延伸：反应体系的温度回升到 72 左右，按照单链 DNA 上的脱氧核苷酸序列，4 种脱氧 核苷酸根据碱基互补配对原则， 在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后， 使引物链延伸， 形成互补的 DNA 双链。 结果 aPCR 扩增一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。 b两引物之间的固定长度的 DNA 序列呈指数扩增。 1PC
4、R 原理 PCR 反应与体内 DNA 复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。 答案 不相同。体内 DNA 复制所需引物为 RNA 聚合酶合成的一小段 RNA，但 PCR 反应时 所用引物一般是人工加入的一小段单链 DNA。 2PCR 反应过程 (1)PCR 反应中需要解旋酶和 DNA 聚合酶吗？若需要，则与细胞内 DNA 复制有何区别？ 答案 PCR 反应不需要解旋酶，但需要 DNA 聚合酶。由于 PCR 反应中需要高温使 DNA 解 旋，因此 PCR 所需的 DNA 聚合酶能耐高温。 (2)PCR 的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。 答案 每次循环中先高温解旋， 再低温使引物与模
5、板结合，最后适当升温有利于 Taq DNA 聚 合酶发挥作用。 (3)结合下图分析 PCR 过程中 DNA 复制的方向是怎样的？ 答案 DNA 的羟基(OH)末端为 3端；磷酸基团的末端为 5端。当引物与 DNA 母链通 过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的 3端开始延伸 DNA 链，DNA 的合成方 向总是从子链的 5端向 3端延伸。 归纳总结 PCR 扩增与 DNA 复制的异同 项目 DNA 复制 PCR 扩增 不同点 时期 有丝分裂间期或减数第一次 分裂的间期 任何时期 场所 活细胞内 细胞外 酶 解旋酶、DNA 聚合酶 耐高温的 Taq DNA 聚合酶 引物 有转录，产生
6、RNA 作引物， 无需人工加入 无转录，无引物产生，需人工加 入两种 DNA 引物 特点 边解旋边复制 先全部解旋后开始复制 缓冲液 不需缓冲液 配制缓冲液代替细胞核液 设备 无 控制温度变化的温控设备 相同点 原理 严格遵循碱基互补配对原则 引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物 模板 DNA 的两条链为模板 特点 半保留复制 原料 游离的四种脱氧核苷酸 1下列关于 DNA 复制和 PCR 技术的描述中，正确的是( ) ADNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 5端延伸 DNA 链 BDNA 复制不需要引物 C引物与 DNA 母链通过碱基互补配对进行结合 DPCR 扩增的对象是
7、氨基酸序列 答案 C 解析 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA， 故 DNA 复制需要引物； DNA 聚合酶只能从 3 端延伸 DNA 链，而不能从 5端延伸 DNA 链；引物通过碱基互补配对原则与 DNA 母链相 结合；PCR 扩增的对象是 DNA，而不是氨基酸序列。 2PCR 技术有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛 应用，与细胞内的 DNA 复制相比，PCR 可以快速扩增所需的 DNA 片段，请分析回答下列有 关问题： (1)体内 DNA 复制过程中用解旋酶打开双链 DNA，而 PCR 技术中的解旋原理是 。 (2)此过程需要一种 Taq DNA
8、 聚合酶。 该酶是从 中分离的。 (3)与普通 DNA 聚合酶相比，Taq DNA 聚合酶具有的特性是 。 (4)与体内 DNA 复制相比较，PCR 反应要在 中才能进行，并且要严 格控制 条件。 (5)PCR 中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。 答案 (1)DNA 的热变性原理 (2)水生耐热细菌 Taq (3)耐高温 (4)一定的缓冲溶液 温度 (5)2 作为 DNA 复制的起点 解析 (1)PCR 技术中用高温使 DNA 分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是 DNA 的热变 性原理。(2)Taq DNA 聚合酶是从水生耐热细菌 Taq 中提取的。(3)与普通 DNA 聚合酶相比，
9、Taq DNA 聚合酶在 90 以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。(4)PCR 反应需要适宜的 温度和 pH，因此 PCR 反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。(5)PCR 需要两种引物，引物的识别位点决定了 PCR 扩增的 DNA 片段。PCR 中加入的引物一般是一 小段单链 DNA， 作用是引导 DNA 复制， 可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键， 成为 DNA 复制的起点。 一题多变 细胞内的 DNA 复制需要适宜的温度和 pH 吗？若需要，是如何实现的？ 答案 需要。细胞内的适宜温度和 pH 与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。 易错提醒 与 P
10、CR 原理有关的三个易错点 (1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使 DNA 两条链之间的氢键断开；DNA 聚合酶与 DNA 连 接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。 (2)DNA 聚合酶和 DNA 连接酶： DNA 聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的 3端 上，需要模板；而 DNA 连接酶连接的是两条 DNA 片段的缺口，不需要模板。 (3)PCR 中的解旋过程：PCR 过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温 度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA 加热变性后变为单链，并未分解成单体。 二、目的二、目的 DNA 片段的体外扩增与鉴定片段的体
11、外扩增与鉴定 1DNA 片段的 PCR 扩增 (1)准备器材：PCR 仪、台式高速离心机、0.2 mL PCR 微量离心管、自动取液器、模板 DNA 等。 (2)在 0.2 mL 微量离心管中加入 5 L 10 倍浓缩的 PCR 缓冲液， 4 种脱氧核苷酸的溶液各 5 L, 1 L 模板 DNA,5 L 引物 1 和 5 L 引物 2,29 L 双蒸水。 (3)煮沸 5 min 之后冰浴 2 min，低速离心，按照 1 单位/L 加入 TaqDNA 聚合酶。 (4)扩增 DNA 片段的反应程序：将微量离心管放入 PCR 仪中，盖上样品池盖。在 94 的条 件下预热 5 min，再设置反应程序为
12、：94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min(以上过程循环 30 次)。最后一次延伸条件为 72 ，1 min。 (5)按照 PCR 仪操作要求运行反应程序。 2DNA 分子的测定 (1)配制二苯胺试剂：分别配制 A 液(1.5 g 二苯胺溶于 100 mL 冰醋酸中，再加入 1.5 mL 浓硫 酸， 用棕色瓶保存)和 B 液(体积分数为 0.2%的乙醛溶液)。 将 0.1 mL B 液加入 10 mL A 液中， 混匀。 (2)条件： 取一定量扩增前和扩增后的溶液分别加入等量的二苯胺试剂， 混匀后观察颜色变化。 用沸水浴加热上述溶液。 (3)现象：出现蓝色现象。 3定量分析方法：如果
13、需要进行定量分析，可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法。 前者需要使用紫外分光光度计，后者需要使用电泳仪等。 1实验过程分析 (1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？ 答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要 盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 (2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？ 答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。 (3)PCR 实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽 灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？ 答案 为避免外源 DNA 等
14、的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后， 取液器上的枪头都必须更换。 2结果检测 (1)实验中为什么要测定 DNA 的含量？ 答案 实际操作过程中会有许多因素影响 DNA 含量，所以需要对 DNA 含量进行测定。 (2)如何判断 DNA 扩增成功？ 答案 可以通过计算 DNA 含量来评价扩增的效果。电泳检测的方法，可以通过在紫外 线下直接观察 DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 (3)PCR 扩增过程可能会出现哪些异常结果？ 答案 样品产物少，或产生新的 DNA。 3进行 PCR 反应的具体实验操作顺序应为( ) 设计好 PCR 仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微
15、量移液器向微量离心管中依 次加入各组分 进行 PCR 反应 离心使反应液集中在离心管底部 A B C D 答案 C 解析 PCR 反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上) 移 液 混合 离心 反应。 PCR 仪是一种自动控制温度的仪器， 设计好循环程序就可以进 行反应了。 4近 20 年来，PCR 技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其 原理是利用 DNA 半保留复制，在试管中进行 DNA 的人工复制(如图)，在短时间内，将 DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。 (1)加热使 DNA 双链间的 键
16、完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。 (2)如果只需要大量克隆模板 DNA 中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。 当温度降低至 55 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在 DNA 聚合酶的作 用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都 是 。 (3)PCR 技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜 的 和 ， 前者由 自动调控， 后者则靠 来维持。 (4)通过 PCR 技术使 DNA 分子大量复制，如果将一个用 15N 标记的 DNA 分子放入试管中， 以 14N 标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则
17、15N 标记的 DNA 分子占全部 DNA 分子总数的比例是 。 答案 (1)氢 解旋 解旋 (2)两 3 从子链的 5端向 3端延伸 (3)温度 酸碱度 PCR 仪 缓冲液 (4)1/8 解析 (1)PCR 技术利用热变性原理使 DNA 双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是 在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR 分为三个基本反应步骤：变性(94 )、退火(55 )、 延伸(72 )，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增 DNA 序列互补的 片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA， 只能从引物的 3端延伸 DNA 链，则
18、 DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。 (3)PCR 技术与细胞内的 DNA 复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要 液体环境(稳定的缓冲溶液)， 每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等。 (4)一个 DNA 分子连 续复制四次之后，形成 16 个 DNA 分子，15N 标记的 DNA 分子有 2 个，则 15N 标记的 DNA 分子占全部 DNA 分子总数的比例为 1/8。 1PCR 技术最突出的优点是( ) A原理简单 B原料易找 CTaq DNA 聚合酶具有耐热性 D快速、高效、灵活、易于操作 答案 D 解析 PCR 技术最突出的优点是快速、高效、灵活和易于操
19、作。Taq DNA 聚合酶具有耐热性 是实验操作成功的关键。 2符合 PCR 反应条件的一项是( ) 稳定的缓冲液环境 DNA 模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 DNA 聚合酶 DNA 解旋酶 限制酶 温控设备 A B C D 答案 D 解析 PCR 反应模拟了生物细胞内 DNA 复制的条件， 只是无需解旋酶(可热变性)， 也不需要 基因工程的工具酶(限制酶)。 3下列关于 PCR 的描述中，正确的是( ) PCR 是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增 DNA 利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列 A B C D 答案 D 解析 PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术，在高
20、温条件下，把 DNA 的双链打开，缓 慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的 DNA 聚合酶，同时，还需要引物，从引物的 3端连 接脱氧核苷酸。 4如图所示为 PCR 扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物( ) A第一次循环 B第二次循环 C第三次循环 D第四次循环 答案 A 解析 在 PCR 反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的 DNA 为模板，两条 DNA 链可分别由引物和引物与其结合并在 DNA 聚合酶的作用下延伸， 所以形成的 DNA 中只 有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的 DNA 分子又可作为模板参与反应，所以会形 成 DNA 分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此
21、题干中所出现的情况是第一次循环的 产物。 5多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。请回答下列问题： (1)DNA 的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为 5端，当引物与 DNA 母 链通过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的 开始延伸 DNA 链。 (2)PCR 利用了 DNA 的热变性原理解决了打开 DNA 双链的问题， 但又导致了 DNA 聚合酶失 活的新问题。 到20世纪80年代， 科学家从一种Taq细菌中分离到 ， 它的发现和应用解决了上述问题。要将 Taq 细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培 养基叫 。 (3)PCR 的每次循环可以分为
22、三步。假设在 PCR 反应中，只有一个 DNA 片段作为模板，请计算在 5 次循环后，反应物中大约有 个这样的 DNA 片段。 (4)简述 PCR 技术的主要应用： (要求至少答两项)。 答案 (1)磷酸基团 3端 (2)耐高温的 Taq DNA 聚合酶 选择培养基 (3)变性、 退火和延 伸 32 (4)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和 DNA 序列测定等 解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基， 另一端是游离的磷酸基团， 含羟基的一端是 3 端，含磷酸基团的一端是 5端。引物的 5端与模板链的 3端结合，然后沿着引物的 3 端延伸。耐高温的 Taq DNA 聚合酶的发现是实现 PCR 的关键，该酶可以利用选择培养基从 一些微生物中分离出来。PCR 一次循环要经历变性、退火和延伸三个阶段。