1、第第 8 课时课时 固定化酶的制备和应用固定化酶的制备和应用 学习导航学习导航 1.简述固定化酶的制作方法。2.简述固定化细胞技术的应用及酵母菌细胞的固定 化技术。 重难点击重难点击 1.简述固定化酶的制作方法。2.简述酵母菌细胞的固定化技术。 一、固定化酶和制备固定化酶的常用方法一、固定化酶和制备固定化酶的常用方法 1固定化酶 (1)概念：固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活 性的酶复合物。 (2)特点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物 分离，可被反复使用。 2制备固定化酶的常用方法 (1)物理吸附法是将酶吸附在纤维
2、素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的 固定方式，其显著特点是工艺简便且条件温和。 (2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价 键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中包埋 成格子型，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中包埋成微胶囊型。 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模地使 用。人们针对酶不能被广泛应用这一情况，一直在寻求改善方法，其中之一就是固定化酶技 术的应用。观察下图所示有关制备固定化酶的常用方法，结合教材回答下列问
3、题： (1)图 A 为物理吸附法，它的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)图 B 为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之 间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图 C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图 D)，包埋成微胶囊型。 归纳提炼 各种固定化酶方法的比较 比较项目 物理吸附法 包埋法 化学结合法 制备 易 较难 较难 结合程度 弱 强 强 活力回收率 高，但酶易流失 高 中等 再生 可能 不可能 不可能 固定化成本 低
4、 低 中等 底物专一性 不变 不变 可变 1如图是酶的几种固定方式示意图，其所采用的固定方法依次是( ) A物理吸附法、化学结合法、包埋法 B化学结合法、物理吸附法、包埋法 C包埋法、物理吸附法、化学结合法 D包埋法、化学结合法、物理吸附法 答案 D 解析 图表示将酶包埋在细微网格里，应属于包埋法；图表示许多酶分子通过特殊载体 连接起来，形成交联网架结构，应属于化学结合法；图表示将酶固定在一定的支持物上， 属于物理吸附法。 2关于固定化酶技术的说法，正确的是( ) A固定化酶技术就是固定反应物，并将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C固定化酶中的酶无
5、法重复利用 D固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术 答案 D 解析 固定化酶是利用物理学或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是反应完成 后容易与水溶性反应物和产物分离，可以重复利用，缺点是无法同时催化一系列酶促反应； 在固定过程中，固定的是酶而不是反应物。 二、固定化细胞技术的应用及酵母细胞的固定化技术二、固定化细胞技术的应用及酵母细胞的固定化技术 1固定化细胞的概念 通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞 固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，可以像游离的细胞一样用于发酵生 产。 2应用：固定化细胞可以取代游离的细胞发挥作用，在生
6、产实践中应用广泛。 (1)在工业生产上，利用固定化植物细胞可以生产多种色素、香精、药物、酶等。 (2)利用固定化微生物细胞可以生产酒精、啤酒、谷氨酸、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维 素酶、青霉素、头孢霉素等。 (3)在医学上，利用固定化动物细胞可以生产小儿麻痹症疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、肝炎 疫苗、口蹄疫疫苗等，还可以生产生长激素、干扰素、胰岛素、催乳素、促性腺激素等。 (4)将固定化的胰岛细胞制成微囊，能治疗糖尿病。 (5)用固定化细胞制成的生物传感器可用于医疗诊断。 (6)在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，用来测定醋酸、乙醇和氨等。 (7)固定化细胞在环境保护、能源开发等领域都有
7、着重要的应用。 3固定化细胞技术的优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成 本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一 系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短，反应快。 正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管固定化细胞技术的出现远远晚于固定化酶 技术，但它的应用范围比固定化酶更广泛。 4固定化细胞技术的缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制
8、。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 5细胞的固定化方法 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法， 适用于各种微生物、 动物和植物细胞的固定化。 凝胶包埋法所使用的载体主要有海藻酸钠凝胶、琼脂、角叉菜胶、明胶等。用海藻酸钠凝胶 包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。 6酵母菌细胞的固定化技术的过程 准备各种实验药品和器材 制备麦芽汁 活化酵母菌细胞 配制物质的量浓度为 0.05 mol/L 的氯化钙溶液 制备固定化细胞 浸泡和洗涤 发酵麦芽汁。 分析下列酵母菌细胞固定化操作流程，回答问题。 准备各种实验药品和器材 主要药品有：干麦芽粉、干酵母、聚乙
9、烯醇(PVA)、海藻酸钠、无 水氯化钙、蒸馏水、葡萄糖溶液、碘液 制备麦芽汁 干麦芽粉蒸馏水 5865 放置34 h 麦芽汁 煮沸、冷却、过滤、调pH 灭菌 无菌麦芽汁 活化酵母菌细胞 干酵母蒸馏水 用玻璃棒 搅拌1 h 活化的酵母菌 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 无水氯化钙蒸馏水 制备固定化细胞 聚乙烯醇(PVA)海藻酸钠蒸馏水 加热、冷却 加入酵母菌培养液酵母菌聚乙烯醇海 藻酸钠溶液 滴入氯化 钙溶液中凝胶珠 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤 待凝胶珠在溶液中浸泡30 min 后，取出并用蒸馏水洗涤3 次备用 发酵麦芽汁 将凝胶珠加入无菌麦芽汁中 1在酵母菌细胞的活化和配制
10、CaCl2溶液时，都使用了蒸馏水，为什么不能使用自来水？ 答案 防止自来水中各种离子影响实验结果。 2配制海藻酸钠溶液时加热是关键，为什么要用小火间断加热？ 答案 防止海藻酸钠溶液焦糊。 3能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？ 答案 不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。 归纳总结 1固定化细胞与固定化酶的主要区别 固定化细胞使用的是活细胞，因而为了保证其生长、增殖的需要，应该为其提供一定的营 养物质。 固定化细胞由于保证了细胞的完整性，酶的环境改变小，所以对酶的活性影响最小。 2凝胶珠的检测：刚形成的凝胶珠应在氯化钙溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结
11、构。 检验凝胶珠的质量是否合格可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用 手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，且没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功；二是在实验 桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。 3关于固定化酵母菌细胞制备过程的叙述，正确的是( ) A为使酵母菌活化，应让干酵母与自来水混合并搅拌 B用小火间断加热可防止海藻酸钠溶液焦糊 C向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母菌细胞，充分搅拌并混合均匀 D将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠溶液倒入 CaCl2溶液中，会观察到 CaCl2溶液中有球形或 椭球形的凝胶珠形成 答案 B 解析 酵母菌细胞活
12、化时，应让干酵母与蒸馏水混合并搅拌，A 项错误；配制海藻酸钠溶液 时要用小火间断加热的方法，否则海藻酸钠会发生焦糊，B 项正确；刚溶化的海藻酸钠应冷 却后再与酵母细胞混合，否则温度过高会导致酵母细胞死亡，C 项错误；将与酵母菌细胞混 匀的海藻酸钠溶液匀速滴入 CaCl2溶液中，D 项错误。 4下面是制备固定化酵母菌细胞的实验步骤，请回答下列问题： 酵母菌细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液 海藻酸钠溶液与酵母菌细胞 混合 固定化酵母菌细胞 (1)在 状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢 复 状态。 活化时应选择足够大的容器， 因为酵母菌细胞活化时 。 (
13、2)固定化细胞技术一般采用包埋法，而固定化酶常用 和 。 (3)影响实验成败的关键步骤是 。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是 。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞数目 。如果形成的 凝胶珠不是圆形或椭圆形， 说明 。 (6)该实验中 CaCl2溶液的作用是 。 答案 (1)缺水 正常(生活) 体积会增大(增多) (2)化学结合法 物理吸附法 (3)配制海藻酸钠溶液 (4)小火间断加热，不断搅拌 (5)较少 (海藻酸钠浓度偏高)制作失败 (6)使胶体聚沉(或形成稳定的结构) 解析 (1)酵母菌细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵母菌恢复到生活状态。酵母菌 细胞活
14、化后体积会增大。(2)固定化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小火间断加热，并不断搅拌，使海 藻酸钠完全溶化，又不会发生焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就会过少；海藻酸 钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)CaCl2溶液能使海藻酸钠发生聚沉，形成稳定的结 构。 一题多变 (1)固定酵母菌细胞的过程中三次使用到蒸馏水，请说出是哪三个环节？ 答案 酵母菌细胞的活化、配制 CaCl2溶液以及配制海藻酸钠溶液时需要使用蒸馏水。 (2)本题中固定酵母菌细胞使用了海藻酸钠，固定化细胞还可以使用哪些固定化材料？ 答案
15、明胶、琼脂、角叉菜胶。 (3)制备好的固定化酵母菌细胞可以用于酒精发酵，如果酵母菌细胞没有活化或溶化好的海藻 酸钠溶液没有冷却就加入了酵母菌细胞，则对酒精发酵会产生怎样的影响？ 答案 如果酵母菌细胞没有活化，则仍处于休眠状态；如果溶化好的海藻酸钠溶液没有冷却 就加入了酵母菌细胞，则酵母菌细胞会被高温杀死。以上两种情况都会导致酒精发酵失败， 而最终无酒精产生。 1下列属于固定化酶应用特点的是( ) 可以被反复利用 有利于酶与产物分离 能自由出入载体 一种固定化酶只催化一 种酶促反应 酶多用包埋法固定化 A B C D 答案 C 解析 酶被固定后可与产物分离，故可反复使用，但不能自由出入依附的载体
16、；通常情况下 固定化酶种类单一，所以不能催化一系列酶促反应，只催化一种或一类酶促反应；酶分子较 小，不适合采用包埋法进行固定化。 2下列关于使用固定化酶技术生产高果糖浆的说法，正确的是( ) A高果糖浆的生产需要使用果糖异构酶 B在反应柱内的顶端装上分布着许多小孔的筛板，防止异物进入 C将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，果糖从反应柱下端流出 D固定化酶技术复杂，成本较高 答案 C 解析 生产高果糖浆时所用的酶应为葡萄糖异构酶，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上， 再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板，酶颗粒无法通过 筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入；生产过程中，将
17、葡萄糖溶液从反应柱的上端注 入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端 流出；反应柱能重复使用，大大降低了生产成本。 3 如图甲表示制备固定化酵母菌细胞的有关操作， 图乙是利用固定化酵母菌细胞进行酒精发 酵的示意图，下列叙述不正确的是( ) A刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液 B图甲中 X 溶液为 CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠 C图乙发酵过程中搅拌的目的是使培养液与酵母菌充分接触 D图甲中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图乙装置中 答案 A 解析 在该实验中，应将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入已活化的酵母菌细胞，
18、 否则高温会导致酵母菌细胞死亡；实验中 CaCl2溶液的作用是使海藻酸钠形成凝胶珠；固定 好的酵母菌细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 3 次备用；发酵过程中用搅拌器搅拌，目的是使培养 液与固定化酵母菌细胞充分接触，有利于发酵的正常进行。 4在制备固定化酵母菌细胞的实验中，CaCl2溶液的作用是( ) A用于调节溶液 pH B用于进行离子交换 C用于胶体聚沉 D用于为酵母菌提供 Ca2 答案 C 解析 海藻酸钠胶体在 CaCl2这种电解质溶液的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，其作用机 理是盐离子的电荷与胶体微粒的电荷相互吸引，形成更大的胶体颗粒。 5如图所示，图甲为人工种子生产过程示意图，图乙为图甲中过
19、程的相关操作。请据图回 答下列问题： (1)图甲中，过程、分别称为 、 。(2)图乙中，包埋形成人工种子的过程 中，先适当加热使海藻酸钠溶化，然后将溶化的海藻酸钠溶液 ，再加入 充分搅拌混合均匀。 (3)若用图乙的方法“制备固定化酵母菌细胞”，海藻酸钠溶液的浓度对实验结果影响较大， 若浓度过高，则 ，通常评价该实验结果主要是观察凝胶珠 的 。 答案 (1)脱分化 再分化 (2)冷却至室温 胚状体 (3)不易形成凝胶珠 颜色和形状 解析 题图是利用植物组织培养技术生产人工种子及用海藻酸钠包埋人工种子的过程。过程 、分别称为脱分化、再分化；海藻酸钠溶液的配制是固定化酵母菌细胞的关键，如果海 藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 的数量较少，都会影响实验效果。