1、课时分层作业 三十八 微生物的培养与应用(30分钟100分)1.(8分)(2018唐山模拟)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。分析回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于_培养基。(2)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力_。(3)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、_和_等。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。【解析】(1)欲筛选出能高效降解原油
2、的菌株，培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。(2)降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。(3)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。无菌技术要求整个实验过程都在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。答案：(1)原油选择(2)强(3)干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰2.(10分)营养缺陷型菌株的诱导和筛选能培育优良的发酵菌种。如图是赖氨酸依赖营养缺陷型菌株的诱导与筛选过程示意图，过程是在过程培养的基础上往培养基中添加了某种物质继续培养。据图分析回答：(1)图中紫外线处理可使野生型菌株中出现营
3、养缺陷菌株，从变异的角度分析，这种变异属于_。(2)从营养物质的成分角度分析，过程所用培养基的特点是_。从物理状态的角度分析，该培养基为_培养基。(3)过程往培养基中添加的某种物质是_。图中菌落较_(填“大”或“小”)的菌株即为赖氨酸依赖营养缺陷型菌株，原因是_。【解析】(1)图中紫外线照射是一种物理诱变因素，可以诱导细菌发生基因突变。(2)要获得长出菌落的平板，所用培养基为固体培养基。与过程相比，过程培养获得的平板上菌落较少，因此过程平板上获得的是野生型菌株，而赖氨酸营养缺陷型菌株不能生长，因此过程所用的培养基为缺乏赖氨酸的培养基。(3)与图中过程获得的平板相比，过程获得的平板上菌落多，且包
4、含大小两种菌落，包括营养缺陷型和野生型两类。过程往培养基中添加的某种物质是赖氨酸。由于添加赖氨酸后，赖氨酸营养缺陷型菌株才能正常生长，因此形成的菌落比野生型菌株的菌落小。答案：(1)基因突变(2)缺少赖氨酸固体(3)赖氨酸小赖氨酸营养缺陷型菌株在添加赖氨酸后才能生长，长成的菌落较小3.(10分)(2018肇庆模拟)很多微生物对人类、动物及植物都是有益的，而且都是必需的，在医学工业方面和日常生活中，我们都是利用微生物发酵法制造出来相应的制品。自然界中的各种微生物是混合生存在一起的，因此在进行某项具体生产时首先要纯化微生物。(1)用接种环进行微生物接种时，操作的第一步及每次划线之前都要灼烧接种环，
5、 目的是对接种环_。(2)配制培养基的操作步骤：_(用字母顺序回答) 。a.倒平板b.计算c.溶化d.称量e.灭菌(3)在制备固体培养基的倒平板操作时， 平板冷凝后， 应将平板倒置， 目的是_。(4)要确定培养液中某种微生物的含量，常用_法和_法进行计数。某同学涂布了四个平板，统计的菌落数是21、212、231和256，则应该取值为_。【解析】(1)平板划线操作的第一步之前要灼烧接种环，这是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养基；以后的每次划线之前都要灼烧接种环，目的是对接种环灭菌，保证后一次划线的菌种仅来自前一次划线的末端。(2)配制培养基的操作步骤是计算称量溶化灭菌倒平板。(3)将平板
6、倒置，可以防止培养皿内壁上的冷凝水流到培养基上，使培养基造成污染。(4)要确定培养液中某种微生物的含量，常用稀释涂布平板法和血球计数板计数法(显微镜直接计数法)进行计数。该同学涂布了四个平板，但其中一个平板的计数结果与另三个相差太远，说明操作过程出现错误，实验数据缺乏正确性，应该去除统计的菌落数21，得到菌落数为(212+231+256)/3=233。答案：(1)灭菌(2)bdcea(3) 防止培养皿内壁上出现的冷凝水污染培养基(4)稀释涂布平板显微镜直接计数/血球计数板计数233【加固训练】秸秆焚烧易造成大气污染，形成雾霾，产生大量有毒物质对人与其他生物造成威胁。如图是利用秸秆生产燃料酒精的
7、流程，据图分析回答：秸秆糖液酒精(1)秸秆预处理后，应该选用_酶进行水解，使之转化为发酵所需的葡萄糖。(2)若要从土壤中分离出生产这种酶的微生物，应用_的选择培养基进行选择培养，且培养基中还应加入_以使该微生物的菌落周围出现_。(3)某同学对这种微生物的培养液进行微生物数量测定，涂布平板时所用稀释液的体积均为0.1 mL，稀释倍数为105对应的平板上菌落数的平均值为12，计算得每毫升样品中的此菌数是1.2107。该同学的做法合理吗？_。理由是_。【解析】(1)秸秆的主要成分是纤维素，应用纤维素酶处理，使之转化为葡萄糖。(2)要从土壤中分离出产生纤维素酶的微生物，应用富含纤维素的选择培养基进行选
8、择培养。利用刚果红染色法可以筛选出纤维素分解菌，其菌落周围会出现不变红的透明圈。(3)用稀释涂布平板法计数微生物时应选择菌落数在30300的平板，而该同学测得平板上菌落数的平均值为12，说明选择的稀释倍数过大，应降低稀释倍数测定菌落数目并计算平均值。答案：(1)纤维素(2)富含纤维素刚果红(不变红的)透明圈(3)不合理用稀释涂布平板法计数微生物时，应选择菌落数在30300的平板4.(10分)(2018深圳模拟)一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的
9、培养基不透明)。(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。现有1 L土壤浸出液，用无菌吸管吸取1 mL至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释至103倍。各取0.1 mL已稀释103倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液中菌体数为_。(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离出目的菌，上述培养基的特点是_。(3)接种技术的核心是_。接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步_，培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是_或有氧条件抑制了这些细菌的生长。(4)在培养基上形成的菌落中，无透明圈菌落利用的
10、氮源主要是_，有透明圈菌落利用的氮源主要是_，据此可筛选出目的菌。实验结果如图显示的AE五种菌株中，_是最理想菌株。【解题指南】解答本题需要关注三点：(1)根据菌落计数的结果计算菌体数。(2)选择培养基的选择作用。(3)能够降解除草剂的微生物的菌落特点。【解析】(1)根据稀释涂布平板法对微生物计数的计算公式：每毫升原土壤浸出液中菌体数=(CV)M=560.1103=5.6105，则每升原土壤浸出液中菌体数为5.6108。(2)该除草剂是含氮元素的有机物，可以为微生物提供氮源，因此选育能降解该除草剂的细菌应使用以该除草剂为唯一氮源(无氮培养基中添加了该除草剂)的培养基作为选择培养基。(3)微生物
11、接种技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。平板划线法接种是通过连续划线将微生物稀释分散到培养基的表面，以获得单细胞菌落。由于培养基以该除草剂为唯一氮源，因此不能降解该除草剂的微生物将不能生长。(4)有些自生固氮微生物可以利用大气中的氮气作为氮源，因此可以在该培养基上生长，但不能降解该除草剂，因此菌落周围不出现透明圈。周围有透明圈的菌落能够降解该除草剂，并且降解该除草剂的能力越强，菌落周围出现的透明圈就越大。答案：(1)5.6108(2)在无氮培养基中添加了该除草剂(3)防止杂菌污染，保证培养物的纯度稀释分散到培养基的表面培养基中缺少这些细菌可利用的氮源(4)氮气该除草剂E【加固训练】(2
12、018威海模拟)有机磷农药应用于农业生产中，有时会造成瓜果蔬菜等食品农药残留超标，对人、畜产生毒性，某班同学欲从土壤中分离高效降解有机磷农药的微生物。回答下列问题：(1)为了获得能降解有机磷农药的微生物菌种，可在被有机磷农药污染的土壤中取样，并在含有碳源、氮源及_等的选择培养基上添加_进行选择培养。(2)将获得的3种待选微生物菌种甲、乙、丙分别接种在1 L含20 mg有机磷农药的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观察实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为32小时、45小时、16小时，则应选择微生物_(填“甲”“乙”或“丙”)作为菌种进行后续培养，理由是_。(
13、3)制备固体培养基的基本步骤是：计算称量溶化分装加棉塞包扎灭菌_。【解析】(1)培养基的主要成分为水、碳源、氮源和无机盐，为了获得能降解有机磷农药的微生物菌种，可在被有机磷农药污染的土壤中取样，在选择培养基上添加有机磷农药进行选择培养。(2)根据题意可知，甲、乙、丙从开始到停止生长所用时间分别为32小时、45小时、16小时，说明微生物丙分解有机磷农药的能力比甲、乙强，因此应选择微生物丙作为菌种进行后续培养。(3)制备固体培养基的基本步骤是计算称量溶化分装加棉塞包扎灭菌倒平板。答案：(1)水和无机盐有机磷农药(2)丙微生物丙分解有机磷农药的能力比甲、乙强(3)倒平板5.(10分)尿素是一种重要的
14、农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用。因此，对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。回答下列问题：(1)对土壤中分解尿素的微生物的分离过程如下：第一步：土壤取样。取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要_(填“消毒”或“灭菌”)。第二步：样品稀释。通常分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度，原因是_。第三步：微生物的培养与观察。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，而_则不能生长繁殖。(注：实验中所用的培养基经检测符合要求，且均在无菌条件下操作)(2)若对土
15、壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用稀释倍数为104的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数_。(3)若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在下表培养基配方中添加的物质是_。若分离得到的是尿素分解菌，则培养基中pH升高使酚红指示剂变为红色，pH升高的原因是_。成分含量KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g酚红指示剂0.01 g尿素1.0 g蒸馏水1 000 mL【解析】(1)取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要灭菌。因为土壤中不同微生物的数量不同，因此分离不同种类的微生物
16、要采用不同的稀释度。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，而不能利用尿素的微生物则不能生长繁殖。(2)此种细菌属于需氧型细菌，主要分布在上层培养液中，因此若未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数偏高。(3)土壤中分解尿素的微生物为异养型生物，表中培养基还缺少充足的碳源，应添加的物质是葡萄糖(作为碳源)，要用于鉴定微生物，还应添加琼脂(固体培养基中的凝固剂)，使培养基呈固态。尿素分解菌合成的脲酶可将尿素分解成氨，使培养基中pH升高，酚红指示剂变为红色。答案：(1)灭菌土壤中不同微
17、生物的数量不同不能利用尿素的微生物(2)偏高(3)葡萄糖、琼脂尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨6.(10分)大肠杆菌是与我们日常生活联系非常密切的细菌，请回答有关检测饮用水中大肠杆菌的问题：(1)检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数量，这种方法称为_。判断下面所示的4个菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是_。(2)用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？_(填“需要”或“不需要”)，其原因是需要判断培养基_，对于固体培养基应采用的检测方法是将_的培养基在适宜的温度下放置一段时间
18、，观察培养基上是否有菌落产生。(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行_(填“消毒”或“灭菌”)处理；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使其内蛋白质变性，还能破坏它的_的结构。(4)检测大肠杆菌实验结束后，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理才能丢弃，以防止培养物的扩散。【解析】(1)D中菌落的分布情况为平板划线法所得。(2)为判断培养基灭菌是否合格，本实验需要设置对照。要判断固体培养基是否被污染，可将未接种的培养基在适宜的温度下放置一段时间，若发现有菌落产生，则说明培养基已被污染。(3)消毒是指使用较温和的物理或化学
19、方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。对培养基和培养器皿进行灭菌处理，操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒。(4)为防止培养物的扩散，对于使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理才能丢弃。答案：(1)稀释涂布平板法D(2)需要是否被杂菌污染(灭菌是否合格)未接种(3)灭菌消毒DNA(4)灭菌7.(12分)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，为土壤样品。请
20、据图回答下列问题：(1)中培养目的菌株的选择培养基中应加入_作为碳源，中不同浓度碳源的培养基_(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定中活细菌数量，常采用_法。(2)为对照，微生物在中不生长，在中生长，与培养基的主要区别在于_；使用_法可以在上获得单菌落。(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？_。【解析】(1)要从土壤中筛选只能降解利用苯酚的细菌菌株，应在培养基中加入苯酚作为碳源。不同浓度碳源的培养基影响细菌的数量。要测定中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法。(2)根据微生物对营养的需求，在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长、抑制或阻止其他杂菌生长的目的，然后再用稀释涂布
21、平板法或平板划线法筛选出单个目的菌落，再进行接种培养即可获得纯目的菌。(3)实验过程中防止其他微生物污染的方法有培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作等。答案：(1)苯酚影响稀释涂布平板(2)的培养基中没有加入苯酚作为碳源，的培养基中加入了苯酚作为碳源稀释涂布平板法或平板划线(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作【加固训练】临床实验表明，服用乳酸菌及其制品具有减少人体血清胆固醇含量、降低心脑血管发病率的功效。下面是从酸奶中筛选出高效降低胆固醇的乳酸菌的实验，请回答下列问题：(1)制备固体培养基(MRS)：在普通的液体培养基中添加碳酸钙和_，加热使其熔化，然后转移到锥形瓶中
22、。经_处理后，待其冷却至50 左右，在酒精灯火焰附近倒平板。(2)将少量酸奶制成110稀释液，再将梯度稀释到10-6的稀释液涂布于添加了碳酸钙的乳酸菌培养基(MRS)平板上，在_(填“有氧”或“无氧”)条件下37 恒温培养72 h。挑取_(填“有”或“无”)溶钙圈(或透明圈)的菌落，用_法接种在MRS培养基上反复纯化至纯种备用。(3)在普通的MRS液体培养基中添加适量_并用超声波振荡乳化20 min，调pH至7.0，然后将纯化后的乳酸菌菌株接种到该培养液中培养，一段时间后用特定显色剂分光光度法离心测定上清液中_的含量，以_作为对照，测定菌株降低胆固醇的能力，筛选出目的菌株。【解析】(1)在液体
23、培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。培养基应使用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)乳酸菌是厌氧微生物，需在无氧条件下培养。乳酸菌发酵产物为乳酸，乳酸溶解碳酸钙，产生透明圈，所以能产生透明圈的菌落即为乳酸菌菌落，挑取后，用平板划线法接种纯化培养。(3)要从酸奶中筛选出高效降低胆固醇的乳酸菌，需在培养基中添加适量的胆固醇，接种培养后测定胆固醇的含量，并与未接种的高胆固醇培养液比较，测定菌株降胆固醇的能力，筛选出目的菌株。答案：(1)琼脂高压蒸汽灭菌(2)无氧有平板划线(3)胆固醇胆固醇未接种的该培养液(2018廊坊模拟)尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生
24、活在土壤中的微生物种类和数量繁多，为探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂1.4 g2.1 g0.2 g10 g1 g15 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定溶到1 000 mL，调pH为7.2(1)培养基中加入尿素的目的是_，从物理形态看，该培养基属于_培养基。“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，为了满足图示锥形瓶中目的菌对氧气的需求，应采用的操作方法是_。(2)图中将细菌(非硝化细菌)转到培养基上时，应采用_法接种，获得
25、单个菌落。接种环的灭菌方法是_。初步筛选出来的菌种，还需要用生化的方法做进一步的鉴定：在此培养基中接种并培养初步筛选的菌种，若pH_(填“降低”“不变”或“升高”)，则说明该菌种能够分解尿素。(3)A同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。若造成A同学实验结果的原因是培养基被杂菌污染。为了确定该原因，其操作思路是_。【解析】(1)分析题表培养基配方可知，此培养基是以尿素为唯一氮源的培养基，这样只有能分解尿素的微生物才能生长，不能分解尿素的微生物因缺乏氮源而无法生长，起到了筛选目的菌的作用。从物理形态看，该培养基配方中含有凝固剂琼脂，属于固体培养基。“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖。为了满足图示锥形瓶中液体培养基中目的菌对氧气的需求，应采用的操作方法是振荡培养(或搅拌)。(2)将图中的菌液转移到固体培养基上需要使用稀释涂布平板法接种。接种环需要进行灼烧灭菌。尿素分解菌能够将尿素转化为氨而使pH升高，若pH升高，则说明该菌种能够分解尿素。(3)根据题意可知，确定培养基被杂菌污染需要将A同学的培养基在不加土壤稀释液的情况下培养，设置空白对照。答案：(1)筛选目的菌固体尿素葡萄糖振荡培养(或搅拌)(2)稀释涂布平板灼烧升高(3)将A同学的培养基在不加土壤稀释液的情况下培养，设置空白对照- 10 -