1、课时分层作业 四十 基 因 工 程(30分钟100分)1.(10分)启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，其结构如图所示，据图回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶的作用特点是_。(2)将切割产生的DNA片段群体与无启动子的探针载体重组，需要用_。(3)若把重组混合物转化给大肠杆菌，为提高转化效率，常用的方法是_。(4)若插入片段中所含的编码区序列的碱基对数目不能被3整除，报告基因能否正常表达？为什么？_。(5)若克隆位点插入了启动子序列，且其中不含编码区序列，但报告基因仍不能正常表达，可能的原因是_。【解析】本题主要考查基因工程的工具和操作方法。(1)限制性核酸内切
2、酶具有酶的专一性，能识别并切割特定的脱氧核苷酸序列。(2)将切割产生的DNA片段群体与无启动子的探针载体重组，可以用DNA连接酶连接二者之间的黏性末端。(3)Ca2+可以增大细胞壁的通透性，提高转化效率。(4)mRNA中相邻的三个碱基决定一个氨基酸，若插入片段中所含的编码区序列的碱基对数目不能被3整除，则与之相连的报告基因不能编码出正确的氨基酸序列，即不能正常表达。(5)启动子插入克隆位点时有两种插入方向，若插入方向错误，则报告基因不能正常表达。答案：(1)识别并切割特定的脱氧核苷酸序列(2)DNA连接酶(3)用Ca2+处理(4)不能。mRNA中相邻的三个碱基决定一个氨基酸，若插入片段中所含的
3、编码区序列的碱基对数目不能被3整除，则报告基因不能编码出正确的氨基酸序列(5)启动子插入方向不正确2.(10分)苦荞是一种有名的经济植物，其含有的黄酮类化合物具有降血糖、血脂等功效。CHS是合成黄酮类化合物的关键酶。有人把经修饰的CHS基因导入苦荞细胞中，培育高产黄酮苦荞品系。按图示回答：(1)过程中将修饰后的CHS基因与Ti质粒连接成重组Ti质粒的酶称为_。这种酶主要有两类，一类是从T4噬菌体中分离得到的，另一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为_。这两类酶都能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_键。(2)图中过程操作前，需先用Ca2+处理农杆菌，使其成为_细胞。(3)检测转基因苦荞培育是否成功
4、，不能用抗原抗体杂交技术进行检测的原因是_，可以比较转基因苦荞与普通苦荞的_含量或测定细胞中CHS含量进行鉴定。【解析】(1)连接重组质粒需要DNA连接酶，从大肠杆菌中分离出的DNA连接酶称为Ecoli DNA连接酶，DNA连接酶作用的对象为磷酸二酯键。(2)Ca2+处理农杆菌，增加膜的通透性，使其成为感受态细胞，利于外源DNA进入。(3)判断转基因苦荞培育是否成功，可以比较转基因苦荞与普通苦荞的黄酮类化合物的含量或细胞中CHS的含量。答案：(1)DNA连接酶Ecoli DNA连接酶磷酸二酯(2)感受态(3)转基因苦荞植株与普通苦荞植株都含有黄酮类化合物黄酮类化合物3.(15分)黑麦草中含有拮
5、抗除草剂草甘膦的基因，该基因编码抗草甘膦酶，从而使草甘膦失去对植物的毒害作用。2015年8月，中国科学院和北京奥瑞金种业有限公司通过转基因技术获得了抗除草剂草甘膦的玉米新品种。培育新品种过程中用到了PCR技术(如图所示)，请回答下列问题：(1)应从_(填“cDNA文库”或“基因组文库”)中选取拮抗除草剂草甘膦的基因，体外获得大量拮抗除草剂草甘膦基因要利用PCR技术，其中的物质A为_。(2)基因工程操作的核心是_。若需要对转入拮抗除草剂草甘膦基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做_实验。(3)若实验现象不理想，为提高抗草甘膦酶活性需利用_工程设计和改造抗除草剂草甘膦的_。【解析】(1)
6、拮抗除草剂草甘膦基因属于真核生物的基因，需从cDNA文库中获得。体外获得大量拮抗除草剂草甘膦基因要利用PCR技术，该技术的原理为DNA双链复制，延伸过程中以DNA每条链为模板，需要引物的加入。(2)基因工程操作的核心是基因表达载体的构建。若需要对转入拮抗除草剂草甘膦基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做喷洒草甘膦的实验。(3)若想提高抗草甘膦酶活性需用蛋白质工程设计和改造抗除草剂草甘膦基因。答案：(1)cDNA文库引物(2)基因表达载体的构建喷洒草甘膦(3)蛋白质基因【知识总结】细胞内DNA复制与PCR技术的比较4.(15分)(2018石家庄模拟)苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白在害虫
7、的消化道内能被降解成有毒的多肽，最终造成害虫死亡，因此Bt基因广泛应用于培育转基因抗虫植物。(1)培育转基因抗虫棉所需的目的基因来自_的基因组，再通过PCR技术扩增。PCR反应中温度呈现周期性变化，其中加热到9095 的目的是_，然后冷却到5560 使引物与互补DNA链结合，继续加热到7075 ，目的是_。(2)限制酶主要是从_中获得，其特点是能够识别DNA分子某种_，并在特定位点切割DNA。(3)科研人员在培育某品种转基因抗虫棉的过程中，发现植株并未表现抗虫性状。可能的原因是_。(4)在基因表达载体中，目的基因的首端和尾端必须含有_，这样目的基因才能准确表达。【解析】(1)根据题意可知，培育
8、转基因抗虫棉所需的目的基因来自苏云金芽孢杆菌的基因组，再通过PCR技术扩增。PCR反应中温度呈现周期性变化，其中加热到9095 的目的是使双链DNA解链为单链，然后冷却到5560 使引物与互补DNA链结合，继续加热到7075 ，目的是在DNA聚合酶作用下进行延伸。(2)限制酶主要是从原核生物(或微生物)中获得，其特点是能够识别DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割DNA。(3)科研人员在培育某品种转基因抗虫棉的过程中，发现植株并未表现抗虫性状。可能的原因是所转的基因未成功导入或导入的基因未能准确表达。(4)在基因表达载体中，目的基因的首端和尾端必须含有启动子和终止子，这样目的基因才
9、能准确表达，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，终止子终止基因的转录。答案：(1)苏云金芽孢杆菌使DNA解链(变性、解旋、受热变性后解链为单链)在DNA聚合酶作用下进行延伸(Taq酶从引物起始进行互补链的合成)(2)原核生物(或微生物)特定的核苷酸序列(3)所转的基因未成功导入或导入的基因未能准确表达(4)启动子和终止子5.(10分)(2018贵州模拟)科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶基因对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：(1)PCR过程所依据的原理是_，该过程需要加入的酶是_。利用PCR技术扩
10、增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_。(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是_。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中_(填“存在的”或“不存在的”)，PCR定点突变技术属于_工程的范畴。(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用_法将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是_。【解析】(1)PCR过程所依据的原理是DNA双链复制，该过程需要加入的酶是耐高温的DNA聚合酶。利用PCR
11、技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是蛋白质空间结构较为复杂，改造困难。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中不存在的，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用农杆菌转化法将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是植物细胞的全能性。答案：(1)DNA双链复制耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)引物
12、(2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难不存在的蛋白质(3)农杆菌转化植物细胞的全能性6.(10分)(2018济南模拟)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_和_。(2)质粒载体用EcoR切割后产生的片段如下：AATTCG GCTTAA为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_。(3)反转录作用的模板是_，产物是_。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术。(4)基因工程中除质粒外，_和_也可作为载体。(5)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直
13、接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_。【解析】(1)当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。(2)为使载体与目的基因相连，不同的限制性核酸内切酶应该切出相同的黏性末端。(3)反转录是指以RNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA的过程，可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR(多聚酶链式反应)。(4)基因工程中可以作为载体的除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(5)大肠杆菌细胞有细胞壁和细胞膜，能阻止质粒(外源DNA)等物质的进入，只能通过Ca2+处理细胞，使
14、细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)才能作为受体细胞。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割产生的DNA片段末端与EcoR切割产生的相同(3)mRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(4)噬菌体的衍生物动植物病毒(5)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱【延伸探究】(1)若把平末端连接起来，应该选用什么酶？提示：T4DNA连接酶。(2)切割载体和目的基因的酶是不是必须选择同一种酶，原因是什么？提示：不是。只要两种酶切割产生的末端相同即可。1.(15分)(2016江苏高考节选)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶
15、切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。【解题指南】解答本题需要注意两方面：(1)从表格中分析各种限制酶的识别序列和切割位点。
16、(2)构建重组质粒时选择的限制酶不能将质粒上的标记基因全部破坏。【解析】(1)从图2中看出，目的基因的两侧含有4种限制酶的切点，但是质粒的两个标记基因中都含有BamH的切点，因此不能用BamH切割质粒，只能用Bcl和Hind限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。如果将重组质粒转入大肠杆菌，需要先用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的感受态。(2)重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，凡是能在平板上长出的菌落，就是含有重组质粒的大肠杆菌。如果用
17、PCR扩增目的基因，所用的引物为图2中引物甲和引物丙，因为这两个引物与模板链结合后能完成目的基因的复制。(3)BamH酶切的DNA末端是，Bcl酶切的DNA末端是，那么连接后连接部位的6个碱基对序列为,对于该部位，这两种酶都不能切开，因为连接以后的碱基序列中没有BamH 和Bcl 能识别的酶切位点。答案：(1)Bcl和Hind(DNA)连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)都不能2.(15分)为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。 (1)外源基因导入受体细胞，常用的载体有_。(2)欲获取转运肽基因，所需三种限制酶(
18、Cla 、Sac 、Xba )的切点如图甲所示。用_和_处理酶D基因和转运肽基因后，可得到_端与_端(填图中字母)相连的融合基因。(3)将上述融合基因插入图乙所示Ti质粒的T-DNA中，构建_并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含_的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用液体培养基振荡培养，可以得到用于转化的侵染液。(4)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是_，进一步筛选后获得转基因油菜细胞，该细胞通过_技术，可培育成转基因油菜植株。【解析】(1)外源基因导入受体细胞，目前常用的载体有质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒等。(2)由题图知，切割酶D基因与转运肽基因的限制酶中相同
19、的为Cla，因此对两种基因处理时用Cla切割，然后用DNA连接酶进行连接，继而可得到A、D端相连的融合基因。(3)将上述融合基因插入图乙所示Ti质粒的T-DNA中，构建基因表达载体(即重组质粒)并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到单菌落，再利用液体培养基振荡培养，可以得到用于转化的浸染液。(4)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞，进一步筛选后获得转基因油菜细胞。该细胞通过植物组织培养技术，可培育成转基因油菜植株。答案：(1)质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒(2)ClaDNA连接酶AD(3)基因表达载体(或“重组质粒”)四环素(4)利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞植物组织培养- 9 -